芋螺毒素(conopeptide, conotoxin, Ctx)是生长于海洋的软体动物芋螺(genus Conus)分泌的一类活性多肽,可以用来捕食、防御和威慑竞争者。自然界含有约700种芋螺,每一种可以分泌超过1000种芋螺毒素肽,且不同种间鲜有重复。由于大多数芋螺毒素可以区分不同种类的离子通道亚型,因此芋螺毒素广泛被用作药理学工具研究离子通道,同时一些芋螺毒素可直接作为潜在的诊断和治疗药物进行开发。α-芋螺毒素是一类序列短,二硫键模式保守的芋螺毒素。a-芋螺毒素序列框架一般为CCXnCXmC, Xn和Xm代表半胱氨酸间氨基酸数目,据此可以将α-芋螺毒素分为a4/3、α4/4、a4/6和α/7亚家族,它们可以作用于不同亚型的乙酰胆碱受体。本实验室前期从Conus textile中鉴定出一种α-4/6芋螺毒素TxID,含有15个氨基酸残基和两对二硫键。本实验利用固相合成法合成了TxID,通过在非洲爪蟾卵母细胞上表达的异源乙酰胆碱受体测试其活性,结果显示阻断大鼠α3β4乙酰胆碱受体的IC50是12.5nM,是迄今发现最强的α3β4乙酰胆碱受体拮抗剂。同时,TxID能够阻断相似的α6/α3β4乙酰胆碱受体,IC50是94nM。α-芋螺毒素TxID可以作为一个新的药理学工具研究α3β4乙酰胆碱受体的结构和功能。本实验进一步利用TxID丙氨酸扫描、同源模拟和分子对接等方法,研究TxID与α3β4乙酰胆碱受体结构与功能的关系。丙氨酸扫描实验结果显示,[H5A]TxID、[P6A]TxID、[V7A]TxID、[M11A]TxID和[P13A]TxID五个突变体丢失抑制α3β4乙酰胆碱受体的活性,表明它们是关键氨基酸。由于TxID中甲硫氨酸容易发生氧化反应,本研究合成了7个甲硫氨酸替代的突变体。电生理记录实验结果显示[S9A/M11L]TxID和[M11L]TxID显著提高了TxID的IC50值。与此同时,本研究还对TxID结构外侧的Ile-14氨基酸进行了改造,三种突变体都对α3β4乙酰胆碱受体有抑制活性,其中TxID[I10D]突变体的活性还有所提升。同源模拟和分子对接结果显示His-5> Val-7和Met-11是TxID活性关键氨基酸,同时也表明α3乙酰胆碱受体亚基上的Loop-B和Loop-C区域扮演重要作用,β4乙酰胆碱受体亚基上Ile-111、Gln-119和Leu-121同样起关键作用。这些研究结果使人们更加了解了α-芋螺毒素TxID与乙酰胆碱受体的作用机制,为后续改造设计镇痛肽提供指导。本研究同时还利用RP-HPLC和ESI-MS技术研究了海南产织锦芋螺毒液多肽的分子多样性,活性筛选发现其中一个组分能作用α3β2乙酰胆碱受体。通过色谱纯化,串联质谱鉴定和化学合成方法鉴定出此毒素组分为α-芋螺毒素TxIA。为了研究二硫键模式和酰胺化等修饰对α-芋螺毒素TxIA和TxID活性影响,本研究利用化学方法合成此两种芋螺毒素的三种二硫键连接异构体和非酰胺化突变体。首次对它们的活性进行了系统研究,实验结果表明二硫键连接方式对TxID活性影响巨大,非天然连接方式的异构体完全丧失活性。TxIA的研究结果与TxID类似,天然芋螺毒素作用α3α2乙酰胆碱受体IC50是5.4nM, ribbon异构体为430nM,而beads异构体几乎没有活性。-芋螺毒素TxID末端非酰胺化改造后,活性几乎没有变化,而TxIA则降低了10倍,这些研究结果加深了我们对二硫键键连接方式和C端酰胺化对芋螺毒素药理学活性影响的了解。本研究利用RP-HPLC技术对TxID在还原谷胱甘肽和生理pH值人血清环境下变化进行研究,.发现TxID在还原环境下,二硫键发生了重排,同时在血清中12小时后,芋螺毒素显著减少。此研究结果促使我们进一步改造TxID,提高其在生理状态下的稳定性。