沙门菌是一种重要的人畜共患病原菌,属于胞内寄生菌,能够感染各种动物,引起多种畜禽疾病(如鸡伤寒、猪副伤寒、鸡副伤寒等),也能够引起人类食物中毒和多种食源性疾病,普遍发生于世界各地,造成严重的经济损失。本研究针对鼠伤寒沙门菌的调控蛋白RtsB和Fur,构建了rtsB和fur基因缺失株及互补株,比较了其与野生株的生物学特性,进一步分析了其对鼠伤寒沙门菌毒力的影响,为深入研究鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。1.鼠伤寒沙门菌rtsB基因缺失株的构建及其生物学特性分析通过序列分析发现鼠伤寒沙门菌的rtsB基因编码LuxR家族调控蛋白,具有典型的螺旋-转角-螺旋DNA结合基序。为了分析调控蛋白RtsB对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响,利用Red同源重组系统及互补质粒构建了鼠伤寒沙门菌SAT52株调控基因rtsB缺失株及互补株,比较分析调控蛋白RtsB对鼠伤寒沙门菌生长特性、运动性、生物被膜形成能力、黏附入侵能力、胞内存活能力及致病性的影响。结果表明,缺失rtsB基因不影响鼠伤寒沙门菌SAT52株的生长速度,但导致运动能力增强,生物被膜形成能力减弱。细胞感染试验结果表明,调控蛋白RtsB有助于鼠伤寒沙门菌SAT52株对Hela细胞的黏附入侵及在RAW264.7细胞内的存活能力。动物试验结果显示,基因缺失株ΔrtsB的致病力显著低于野生株。上述结果表明,调控蛋白RtsB参与鼠伤寒沙门菌的黏附入侵、胞内存活等感染过程,从而发挥致病作用,可为阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制提供参考。2.鼠伤寒沙门菌摄铁调控蛋白编码基因fur缺失株的构建及其生物学特性分析摄铁调控蛋白Fur通过调控基因表达参与细菌的生存、毒力等过程。利用Red同源重组系统及互补质粒构建了鼠伤寒沙门菌SAT52株的摄铁调控蛋白编码基因fur缺失株及互补株,并分析调控蛋白Fur对鼠伤寒沙门菌生物学特性和致病性的影响。结果表明,调控蛋白Fur缺失导致沙门菌SAT52株的生长速度轻度降低,但有助于鼠伤寒沙门菌SAT52株的菌间竞争能力。细胞感染及动物试验结果显示,Fur有助于鼠伤寒沙门菌SAT52株在RAW264.7细胞内的存活能力、体内定殖能力,从而促进毒力。结果表明,调控蛋白Fur参与鼠伤寒沙门菌的感染致病过程,为阐明fur基因在鼠伤寒沙门菌致病过程中的作用机制提供参考。3.鼠伤寒沙门菌摄铁调控蛋白Fur调控Ⅵ型分泌系统参与致病的分子机制细菌严格调控Ⅵ型分泌系统(T6SS)表达从而促进菌间竞争能力、毒力等,而鼠伤寒沙门菌是否通过Fur调控T6SS参与致病尚不清楚。本文利用Red同源重组系统及互补质粒构建鼠伤寒沙门菌SAT52株T6SS clpV基因缺失株、互补株及fur和clpV双基因缺失株,并通过荧光定量PCR、Western blotting、β-半乳糖苷酶试验、凝胶迁移试验(EMSA)、DNase I足迹分析试验和点突变技术,分析Fur对T6SS clpⅤ转录表达的调控作用及机制;最后分析Fur调控T6SS clp Ⅴ对鼠伤寒沙门菌致病性的影响。结果显示,感染和缺铁条件可以促进鼠伤寒沙门菌SAT52株SPI-6 T6SS的核心成分clp V的表达,且Fur可以抑制鼠伤寒沙门菌clp V的表达及T6SS的分泌功能。凝胶迁移试验(EMSA)、DNase I足迹试验和点突变分析结果表明,Fur可以直接结合clpV启动子多个位点发挥调控作用。解除Fur对T6SS clpV的抑制作用,可以促进鼠伤寒沙门菌的细菌间竞争能力和致病力。本文揭示了鼠伤寒沙门菌Fur调控T6SS参与致病的分子机制,为阐明病原菌的适应性和毒力提供了参考。