论文部分内容阅读
背景食管癌(Esophageal carcinoma,EC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一,据2018年世界本地区癌症发病率及死亡率等研究统计显示,其发病率位列所有恶性肿瘤的第7位、死亡率排名第6位。而根据2015年中国癌症统计报告,中国食管癌发病率明显高于西方国家,而死亡率排名第4位,已成为严重威胁公共健康的疾病之一。食管癌最主要的两种病理类型分别是食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinaoma,EAC),其它少见的有腺鳞癌、小细胞癌或印戒细胞癌等。而在我国乃至整个东亚地区确诊的食管癌患者中有超过90%的患者病理类型为鳞癌。近几十年来伴随科学技术的发展,针对食管鳞癌的治疗方法,如手术、放疗、化疗等治疗手段也不断发展和提升,但食管鳞癌的死亡率仍然很高。据大量流行病统计分析,由于早期食管癌患者临床症状不典型,造成多数食管癌患者就诊时伴随着进食困难、胸痛等已处于中晚期,因此治疗的预后往往较差,5年生存率不超过20%。因此,食管鳞癌的治疗已达瓶颈。目前临床医生越来越意识到针对食管鳞癌治疗应做好早期预防与早期治疗;而另一重要方面是人们在基因和分子水平上对食管鳞癌发生发展机制认识不充分。因此,探索、明确食管鳞癌发生、发展的具体机制是当前临床工作的迫切需要,而通过食管癌肿瘤发病机制的明确继而去寻找诊断、治疗以及预测预后的新型分子靶点将更具有重要的临床价值和理论意义。人类基因组中具有可编码蛋白功能的基因核酸序列比例远低于2%,绝大数基因转录为不能编码蛋白功能的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)。在众多类型的非编码RNA中,长度200-100000nt之间的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)的研究越来越深入,并发现lncRNA通过表观遗传、转录和转录后机制调控肿瘤发生、生长和转移的多种生物学过程。因此,lncRNA可能作为肿瘤抑制因子或癌基因调控多种癌症的发生发展。近年来,越来越多的证据表明,lncRNA通过与内源性RNA竞争来调控肿瘤的进展。因此,我们运用生物芯片分析食管鳞癌与癌旁组织中存在明显差异的LncRNA,进一步行筛选及功能验证,从而研究lncRNA DLX6-AS1的生物学功能及其在食管鳞癌中的调控机制,能够更全面的理解食管鳞癌的发生机理,寻找食管鳞癌诊断标志物及治疗靶点。本研究中,我们发现lncRNA DLX6-AS1在食管鳞癌组织中与在癌旁组织中相比较往往呈现明显高表达,且与预后呈负相关,随后我们揭示了lncRNADLX6-AS1能够明显地促进肿瘤细胞的增值、侵袭及转移并抑制凋亡。通过TCGA数据库中食管鳞癌转录组测序数据进行的生物信息学分析筛选以及进一步的细胞实验验证,我们发现lncRNA DLX6-AS1特异性结合miR-100-5p发挥海绵样作用抑制miR-100-5p的功能,从而反向调控miR-100-5p靶向及致癌基因mTOR;此外在体内移植瘤实验中,我们也发现:在裸鼠皮下肿瘤中移植敲除lncRNADLX6-AS1的食管鳞癌细胞会同时抑制肿瘤的体内生长。综上所述,我们在食管鳞癌中提出并验证了 lncRNA DLX6-AS1/miR-100-5p/mTOR轴调控食管鳞癌细胞增殖、侵袭及转移等功能,为未来食管鳞癌的早期诊断、生物学干预或治疗靶点提供了新思路。目的1.通过生物芯片分析,寻找有差异表达lncRNA并验证。2.评估食管鳞癌组织中lncRNA DLX6-AS1异常表达及与临床病理特征相关性分析。3.研究lncRNADLX6-AS1在食管鳞癌细胞系中的功能。4.进一步探索lncRNADLX6-AS1作用机制的初步研究。方法1.利用TCGA下载的96例食管鳞癌组织标本和13例正常组食管组织标本的RNA测序数据,识别差异表达lncRNAs;收集了 44例食管鳞癌术后癌组织及癌旁组织标本,运用qRT-PCR检测差异表达的lncRNAs。2.利用免疫组化、CCK-8、流式细胞周期分析、蛋白免疫印迹法、构建lncRNA DLX6-AS1低表达质粒、迁移及侵袭法、裸鼠肿瘤异体移植模型等方法学检测lncRNADLX6-AS1在体外及体内对食管鳞癌的影响。3.利用蛋白免疫印迹法、qRT-PCR实验、双荧光素酶报告等实验,检测lncRNA DLX6-AS1/miR-100-5p/mTOR 信号通路作用机制。结果1.通过TCGA数据库及临床样本的分析验证,筛选食管鳞癌组织中高表达lncRNADLX6-AS1。2.进一步实验发现,下调DLX6-AS1能抑制ESCC细胞的生长。在体外,沉默DLX6-AS1可以抑制ESCC细胞的增殖,加速细胞凋亡。随后发现,下调DLX6-AS1抑制了细胞迁移。当DLX6-AS1下调时,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR、凋亡相关蛋白BCL-2和侵袭相关蛋白MMP-2也随之下调。裸鼠移植瘤体内实验结果显示下调DLX6-AS1抑制了移植瘤的生长。3.双荧光素酶实验确定了 lncRNADLX6-AS1与miR-100-5p的靶向结合作用。通过细胞功能实验从而检测到lncRNADLX6-AS1竞争性抑制miR-100-5p调节候选靶基因mTOR,促进食管鳞癌的生长及迁移功能。结论lncRNADLX6-AS1在食管鳞癌组织中异常高表达,可作为食管鳞癌的潜在标志物。同时,lncRNADLX6-AS1可显著的促进食管鳞癌细胞的增值能力、迁移及侵袭能力。此外,lncRNADLX6-AS1竞争性抑制miR-100-5p调节候选靶基因mTOR,促进食管鳞癌的生长及迁移功能,从而为临床食管鳞癌治疗提供新的研究策略。