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目的:1.采用牺牲模板的微通道致孔方法制备具有定向交叉微通道纤维环及多孔髓核结构的丝素蛋白一体化支架;2.体外检测该仿生微通道丝素蛋白一体化椎间盘支架的生物相容性并观察其微通道结构对细胞行为的调控作用;3.皮下埋植实验评估该仿生微通道丝素蛋白一体化椎间盘支架的体内生物相容性并观察其微通道结构对组织浸润生长的引导作用;4.鼠尾椎间盘完整置换评估该仿生微通道丝素蛋白一体化椎间盘支架的组织整合及修复能力。方法:1.以PCL为材料采用熔融纺丝技术制备±30°斜交叠层纤维环致孔模板,中央髓核区域以石蜡球作为致孔模板,然后灌注浓度为15%的丝素蛋白溶液,负压冷冻干燥后分别使用三氯甲烷和正己烷将PCL以及石蜡材料洗脱沥滤掉,从而制备出具有斜交叠层微通道纤维环结构及多孔海绵状髓核结构的丝素蛋白一体化椎间盘支架。采用扫描电子显微镜(SEM)和micro-CT观察支架的微观结构并测量纤维环区域微通道内径和髓核区域多孔结构的孔径大小;利用质量体积法测量支架的孔隙率、拉曼光谱分析支架的材料成分、力学测试仪器测定支架的力学性能。2.支架严格灭菌后,将3T3细胞接种至支架表面,普通细胞培养箱常规培养4天,Live/dead染色评估支架的细胞相容性及细胞在支架内部的迁移能力;CCK-8方法评估细胞在支架上的增殖能力;鬼笔环肽染色(FITC-Phalloidin)及SEM表征细胞在纤维环及髓核不同区域的生长状态。3.灭菌后的支架埋植于大鼠皮下,分别于术后2周和4周取材,4%多聚甲醛固定,梯度乙醇脱水后常规石蜡包埋,然后4μm连续性石蜡切片。HE染色观察组织在支架内部的迁移程度及血管化情况;巨噬细胞特异性标志物(CD68、CD206、i NOS)的免疫荧光染色评估支架的体内生物相容性。4.分别将仿生椎间盘支架及空白对照支架植入鼠尾椎间隙,分别于术后2周、4周及12周采集鼠尾核磁共振(MRI)图像并取材,鼠尾样本分两部分保存:一部分样本冻存于-80℃冰箱用于体内再生后的力学检测;另一部分样本使用EDTA脱钙液进行充分的脱钙处理,常规石蜡切片及组织学染色分析。HE染色观察支架与原生组织的整合生长情况;天狼猩红染色及阿尔新蓝染色检测鼠尾椎间隙新生组织的化学成分。结果:1.SEM和micro-CT图像显示成功制备了具有仿生微通道结构的丝素蛋白一体化支架,其中纤维环区域具有斜交叠层微通道结构,并且微通道之间具有连通性;髓核区域具有海绵状多孔结构,各微孔之间高度连通。纤维环微通道内径为110±15μm,髓核微孔直径为170±22μm;仿生椎间盘支架的孔隙率为89.33±6.58%,空白对照支架的孔隙率为69.52±5.25%;拉曼光谱显示该仿生支架的化学成分为单纯的丝素蛋白材料;力学性能检测显示该仿生支架的压缩模量为3.12±0.25Mpa。2.Live/dead染色结果显示3T3细胞易于粘附于支架表面,具有良好的存活能力;细胞增殖结果证实细胞在支架上具有良好的增殖能力;FITC-Phalloidin染色和SEM结果显示细胞在纤维环和髓核不同微通道结构中呈现不同的增殖形态。3.皮下埋植支架的HE染色结果显示仿生椎间盘支架和对照组支架均与皮下组织整合良好,仿生椎间盘支架中皮下组织通过微通道长入充分,并可见明显的微血管生成,而对照组支架组织细胞难以长入;巨噬细胞免疫荧光染色显示2周时仿生椎间盘支架内部有较多M1型巨噬细胞聚集和少量M2型巨噬细胞聚集,4周时M1型巨噬细胞明显减少而M2型巨噬细胞明显增多。4.仿生椎间盘支架和对照支架植入鼠尾后,均可部分维持椎体间高度。鼠尾MRI结果显示仿生椎间盘支架和对照组支架植入节段均表现为高度含水的高信号,而单纯椎间盘切除节段高信号消失;术后4周和12周的鼠尾运动节段力学性能结果显示两组支架植入后均能部分恢复鼠尾椎间盘生物力学性能,并且仿生椎间盘支架组力学性能优于对照支架组。HE染色发现两组支架植入后均能与邻近椎体组织融合生长,椎体间隙可见大量软组织生长;天狼猩红和阿尔新蓝染色显示椎体间组织成分主要为大量胶原纤维和少量蛋白多糖。结论:1.成功制备了一种新的仿生微通道丝素蛋白一体化椎间盘支架,它具有与天然椎间盘组织相似的空间结构及力学性能。2.该仿生微通道丝素蛋白一体化椎间盘支架具有良好的生物相容性,其不同的仿生微通道结构可以引导细胞呈现不同生长形貌。3.鼠尾椎间盘体内原位修复表明该仿生椎间盘支架可以与大鼠原生组织良好的融合生长,并且有助于恢复椎间盘高度和部分力学性能,为退变椎间盘再生修复研究提供一种有潜力的组织工程方法。