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研究目的黑色素瘤是致死率最高的皮肤肿瘤。黑色素瘤是一种可以预防的恶性肿瘤,但是其发病率仍在逐年上升,现已成为我国癌症发病率增长最快的肿瘤之一。肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种区别于传统的肿瘤血管微循环模式,其管壁由肿瘤细胞构成,对传统的抗血管治疗反应不佳。非肿瘤细胞因素的肿瘤微环境对肿瘤进展的影响不容忽视,各种免疫细胞和细胞因子是其重要的组成部分。白细胞介素-33(IL-33)作为肿瘤微环境中常见的炎症因子对多种肿瘤的进展有着重要影响。IL-33可以通过其特异性受体ST2作用于免疫细胞,激活宿主免疫应答反应发挥抗肿瘤作用。IL-33也可以与肿瘤细胞表面配体结合,启动其下游信号通路直接对肿瘤产生影响。然而,截至目前,IL-33对黑色素瘤的影响尚不明确,因此本研究拟探讨IL-33对黑色素瘤的影响及其作用机制。通过免疫组织化学染色实验初步分析66例黑色素瘤组织中IL-33受体ST2与VM的关系,并通过细胞和分子生物学实验验证IL-33黑色素瘤进展和VM形成的影响及其作用机制,为临床黑色素瘤免疫治疗和靶向治疗寻找新靶点提供思路。研究方法1.收集来自天津肿瘤医院经手术切除黑色素瘤组织标本66例,每例病例均经两名以上病理医师确诊后随访收集全部病例资料,采用免疫组化染色和CD34/PAS双重染色方法检测黑色素瘤组织中ST2、MMP-2的表达水平和VM存在情况。分析ST2的表达与黑色素瘤临床病理因素、VM和MMP-2之间的关系。2.选用两种组织来源不同的黑色素瘤细胞系(A375、MUM-2B),构建ST2sh RNA质粒,通过质粒转染方法获得ST2沉默表达的稳定转染细胞系。随后用Western-blot检测转染效果。在IL-33不同浓度条件下,对ST2下调组和对照组细胞进行平板克隆、MTT实验、划痕、Transwell迁移、侵袭实验及Matrigel三维培养实验检测IL-33对黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭及VM管道形成能力的影响。3.运用Western-blot实验和RT-PCR实验检测不同浓度IL-33作用下A375和MUM-2B细胞VM相关标记物MMP-2和MMP-9的表达情况。引入MKK阻断剂U0126阻断A375和MUM-2B细胞ERK1/2磷酸化。检测在相同浓度IL-33作用下,MMP-2和MMP-9表达量的变化,进而探究IL-33影响黑色素瘤细胞MMP-2和MMP-9表达的信号通路。为进一步验证IL-33影响黑素瘤细胞功能的关键蛋白,在引入U0126和IL-33的情况下对A375和MUM-2B细胞进行Transwell迁移、侵袭和Matrigel三维培养检测细胞的迁移、侵袭和三维管道形成能力变化。研究结果1.在收集的66例患者黑色素瘤组织中,发现32例存在VM现象,32例MMP-2阳性,38例ST2阳性。在32例VM阳性的病例中,MMP-2的阳性表达为21例(65.6%,21/32)。在38例ST2阳性的病例中,MMP-2和VM的阳性表达分别为29例(76.3%,29/38)和23例(60.5%,23/38)。统计结果显示,人黑色素瘤组织中VM现象与MMP-2存在显著相关性,ST2的表达情况与MMP-2表达、VM现象显著相关(P<0.05)。2.平板克隆和MTT实验结果显示,在一定浓度IL-33作用下,A375和MUM-2B细胞增殖能力上调。细胞划痕和Transwell迁移、侵袭实验结果发现,在相同浓度IL-33作用下,A375和MUM-2B细胞划痕愈合速度加快;穿过小室膜和Matrigel细胞数目增多。在不同浓度IL-33条件下,进行Transwell迁移和侵袭实验发现,随IL-33浓度上升,A375和MUM-2B细胞迁移和侵袭能力上升。在IL-33作用下,Matrigel三维培养,A375和MUM-2B细胞成管能力增强。3.Western-blot和PCR实验发现IL-33作用下A375和MUM-2B细胞MMP-2和MMP-9表达量上调,p-ERK1/2表达量上升;当增加IL-33浓度时,MMP-2和MMP-9的表达量也随之上升。为进一步验证ERK1/2与MMP-2/9表达的关系,引入MKK抑制剂U0126阻断ERK1/2磷酸化,IL-33作用下A375和MUM-2B细胞MMP-2/9表达下调;Transwell迁移和侵袭实验发现A375和MUM-2B细胞穿过小室数目下降;三维培养显示细胞成管能力减弱。研究结论1.人黑色素瘤组织中存在VM现象,且VM与IL-33受体ST2表达存在相关性。并且ST2表达情况与VM标志蛋白MMP-2相关。2.在体外,IL-33/ST2可以促进黑色素瘤细胞增殖能力,并且以计量依赖方式促进黑色素瘤细胞迁移和侵袭能力,同时促进VM的形成。3.IL-33/ST2通过上调黑色素瘤细胞ERK1/2磷酸化促进MMP-2和MMP-9表达,进而增强黑色素瘤细胞的迁移和侵袭能力,并且促进VM的形成。即IL-33/ST2通过调节黑色素瘤细胞ERK1/2-MMP-2/9促进细胞迁移侵袭和VM形成。