【摘 要】
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目的:1.探究Erastin联合紫草素对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。2.研究Erastin是否促进紫草素对结直肠癌细胞乳酸、活性氧（ROS）水平的影响。3.探讨Erastin是否促进紫草素对结直肠癌细胞凋亡的诱导及其可能机制。方法:1.采用Erastin(0、4、8、16、32和64μmol?L-1)和紫草素(SW480:0、0.5、1、2、4、8μmol?L-1与SW620:0、
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目的:1.探究Erastin联合紫草素对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制。2.研究Erastin是否促进紫草素对结直肠癌细胞乳酸、活性氧（ROS）水平的影响。3.探讨Erastin是否促进紫草素对结直肠癌细胞凋亡的诱导及其可能机制。方法:1.采用Erastin(0、4、8、16、32和64μmol?L-1)和紫草素(SW480:0、0.5、1、2、4、8μmol?L-1与SW620:0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μmol?L-1)单独作用以及10μmol?L-1Erastin与各浓度紫草素联合作用于结直肠癌SW480、SW620细胞,使用CCK-8法检测细胞活力。2.倒置显微镜观察细胞形态变化:将人结直肠癌细胞SW480和SW620接种于六孔板,细胞分为4组,含DMEM培养液的对照组,10μmol?L-1Erastin组,2μmol?L-1紫草素（SW480）组(SW620:1μmol?L-1紫草素)以及两者联合用药组,继续培养24 h后使用倒置显微镜拍照。3.根据CCK-8检测结果使用Compu Syn软件计算结合指数CI。CI=1表示两药起到相加作用;CI＜1表示协同作用;CI＞1表示拮抗作用。Erastin浓度为10μmol?L-1,紫草素浓度梯度分别为1、2、4和0.5、1、2μmol?L-1作用于SW480和SW620细胞。4.采用集落克隆形成实验和Transwell实验检测联合用药是否比单用紫草素对结直肠癌细胞有更明显的抑制作用。5.Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡;活性氧检测试剂盒测定结直肠癌细胞内活性氧含量的变化;10μmol?L-1Erastin与2μmol?L-1和1μmol?L-1紫草素分别单独或联合作用于SW480、SW620细胞,测定细胞内乳酸含量的变化。6.Western blot检测结直肠癌细胞E-cadherin、N-cadherin、vimentin、Bax、Bcl-2、PARP1、Caspase3、Caspase8以及AMPK/Akt/m TOR信号通路蛋白的表达情况。结果:1.Erastin与紫草素单用及联合应用均对结直肠癌细胞的活性有抑制作用,但联合应用抑制作用更明显。使10μmol?L-1Erastin分别与不同浓度紫草素(SW480:1,2,4μmol?L-1;SW620:0.5,1,2μmol?L-1)联合,经Compu Syn软件计算出CI值＜1（Table 1）,表明联合用药具有协同抗癌作用。2.在倒置显微镜观察下,10μmol?L-1Erastin处理组细胞形态和密度与对照组相比无明显差别,2μmol?L-1和1μmol?L-1紫草素处理组细胞密度减少,而联合用药组细胞形态与密度则有明显的改变。3.集落克隆形成实验和Transwell实验结果表明,联合用药组比单用紫草素组明显抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。4.Erastin使紫草素对结直肠癌细胞乳酸产生的抑制作用更加明显;使细胞内活性氧含量明显增高。Annexin V/PI双染法结果表明Erastin提高了紫草素对结直肠癌细胞的促凋亡作用,细胞凋亡率明显增加。5.Western blot结果表明,与单独使用Erastin或紫草素相比,联合治疗抑制EMT的作用更明显。联合组上皮标志物E-cadherin表达上调明显,而间质标志物N-cadherin和vimentin表达明显下调。10μmol?L-1Erastin和1μmol?L-1紫草素两者合用组AMPK蛋白的磷酸化明显高于单用紫草素组,而Akt蛋白和m TOR蛋白的磷酸化明显低于单用紫草素组。与流式细胞仪结果一致,Erastin处理明显增强紫草素诱导的caspase-3和caspase 8的激活,进而Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 8和Cleaved-parp1表达增加。结论:1.Erastin和紫草素联合应用在体外通过抑制EMT进而抑制结直肠癌细胞的侵袭和迁移。2.Erastin和紫草素联用可能通过激活磷酸化AMPK和抑制p-Akt、p-m TOR信号传导来诱导细胞凋亡。3.Erastin作为紫草素的增效剂,可能是通过诱导细胞内氧化应激、抑制乳酸的产生进而使促凋亡蛋白高表达,抗凋亡蛋白低表达来实现协同抗癌作用。
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