论文部分内容阅读
目的:骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-MSCs)移植治疗心肌梗死被认为是一种有效的治疗方法,然而炎性微环境导致移植的BM-MSCs生存率和分化率低,限制了其疗效,提高BM-MSCs的生存率和分化能力以提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效十分重要。Latifolin是从中药降香中分离出来的单体化合物,研究报道表明latifolin具有抗炎作用,前期研究发现latifolin对心肌细胞具有保护作用,可降低心肌组织炎细胞浸润,提高心功能。因此,推测latifolin可通过改善炎性微环境提高BM-MSCs生存率和增强BM-MSCs定向分化能力,进而提高BM-MSCs移植治疗心肌梗死疗效。本研究探索latifolin对BM-MSCs生存率和心肌定向分化的作用,以达到增强BM-MSCs移植治疗缺血性心脏病目的,为心肌梗死细胞治疗和心肌再生研究奠定基础。研究方法:1.采用全骨髓提取法收集大鼠BM-MSCs,倒置显微镜观察培养细胞形态;采用流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45。2.采用噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium,MTT)法和Annexin V-FITC/PI双染法测定缺血、缺氧和炎性微环境对BM-MSCs活力和凋亡的影响;采用RT-PCR和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测缺血、缺氧和炎症环境对BM-MSCs炎性因子表达和分泌影响;MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法测定latifolin对BM-MSCs的活力和凋亡作用;ELISA测定latifolin对BM-MSCs炎性因子的影响。3.将BM-MSCs分为正常组、5氮杂胞苷(5-azacytidine,5Aza)诱导组、5Aza+latifolin诱导组和latifolin诱导组,显微镜下观察BM-MSCs向心肌细胞分化的形态学变化;RT-PCR检测心脏特异性基因转录因子GATA4、NKX2.5和肌细胞增强因子-2C(myocyte enhancer factor2C,MEF2C)的表达;免疫荧光染色检测心脏特异性蛋白α-肌动蛋白(alpha sarcomeric actin,a-actinin)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达;透射电镜观察各组骨髓间充质干细胞分化的超微结构。4.(1)体外建立BM-MSCs和H9c2共培养体系,实验分组分别为:H9c2正常组;H9c2模型组;H9c2+MSC共培养组;H9c2+MSC共培养+药物(2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)组,对共培养体系进行缺血缺氧和炎症造模处理,经latifolin干预后,采用Annexin V/PI测定H9c2凋亡情况;(2)冠状动脉左前降支结扎建立急性心肌梗死模型,实验共分成9组:假手术组、MI模型组、MSC移植组、MSC移植+latifolin(25,50,100 mg/kg)组、latifolin(25,50,100 mg/kg)组,PowerLab监测冠状动脉左前降支结扎前后心电图ST段变化以评价造模情况;检测给药7d血清中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase isoenzyme MB,CK-MB)含量以评价心肌损伤情况;心脏超声评价心功能;TTC染色法测定梗死面积;HE染色评价心肌病理损伤;Masson染色评价心肌胶原纤维化;免疫荧光法检测BM-MSCs生存率和分化情况;免疫组化测定CD68和MPO阳性表达数量;WB检测心肌组织中IL-6、p-NF-κB、β-catenin和缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达情况。结果:1.倒置显微镜观察BM-MSCs呈纺锤形,放射性及螺旋生长;流式细胞仪检测BM-MSCs表面抗原CD29、CD90、CD34和CD45表达率分别为:99.8%、99.5%、0.2%、4.7%。2.(1)MTT和Annexin V-FITC/PI检测结果显示,氧糖剥夺6h和12h后细胞活力明显增强,氧糖剥夺24h后细胞活力显著降低,在氧糖剥夺+肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)及内毒素(lipopolysaccharide,LPS)条件下6、12、24h细胞活力显著降低;(2)ELISA和RT-PCR结果显示,氧糖剥夺6、12 h降低上清中白细胞介素-6(interleukin 6,IL-6)、白细胞介素-10(interleukin 10,IL-10)水平和细胞中IL-6、IL-10、TNF-α、核转录因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)基因表达;氧糖剥夺+TNF-α及LPS条件6、12 h显著升高上清中IL-6、TNF-α水平和细胞中IL-6、TNF-α、NF-κB基因表达;(3)MTT和Annexin V/PI结果显示,10μg/mL剂量下latifolin显著增加氧糖剥夺+TNF-α条件下BM-MSCs活力,显著降低其凋亡,latifolin显著降低氧糖剥夺+TNF-α条件的BM-MSCs分泌的IL-6、TNF-α水平。3.(1)BM-MSCs在单独用5Aza诱导和latifolin联合5Aza诱导2周后表现出形态上变化,其细胞膨大凸起,在第3周和第4周细胞间出现连接,形成肌管样结构;(2)RT-PCR结果显示,5μg/mL latifolin联合5Aza诱导组显著升高BM-MSCs特异性基因GATA4,NKX2.5和MEF2C表达;(3)免疫荧光染色的结果显示,5Aza诱导组及latifolin联合5Aza诱导组存在明显的心脏特异性蛋白质a-actinin和cTnI的表达;(4)透射电镜结果显示,latifolin联合5Aza诱导组的BM-MSCs分化后细胞质中有明显的心房颗粒、肌丝、丰富的线粒体和粗面内质网。4.(1)latifolin促进BM-MSCs修复受损心肌细胞的作用:Annexin V/PI测定结果显示,与正常组比,H9c2模型组细胞凋亡比例显著性升高;与模型组比较,H9c2+MSC共培养组、H9c2与MSC共培养+药物(10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL)组均能显著性降低H9c2凋亡比例;与H9c2+MSC共培养组比较,H9c2+MSC+10μg/mL给药组能显著降低H9c2凋亡。(2)latifolin促进BM-MSCs移植治疗心肌梗死作用及机制研究:(1)PowerLab检测结果显示,心肌梗死后心电图有ST段明显抬高表现;(2)给药7d后,MSC+latifolin高剂量组显著降低LDH含量,显著降低CK-MB含量;(3)超声结果显示,MSC+latifolin高剂量组显著升高左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室缩短分数(Left ventricular shortening fraction,LVFS)和心输出量(Cardiac output,CO),显著提高心功能;(4)TTC染色结果显示,模型组梗死面积达到39%,单独MSC组及MSC与latifolin联合组均能显著性降低梗死面积;(5)HE染色结果显示,MSC+latifolin高剂量组明显改善梗死周边炎症细胞浸润和肌丝溶解情况;(6)Masson染色结果显示,MI造模后梗死区呈大面积蓝色染色,胶原纤维化明显,MSC+latifolin中、高剂量组显著减少心肌胶原纤维化面积;(7)免疫荧光检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显著增加BM-MSCs在心肌组织中的生存率和分化率;(8)免疫组化测定结果显示,MSC移植组+latifolin低、中、高剂量组和latifolin低、中、高剂量组均能显著降低CD68阳性表达数量,对MPO阳性表达数量无显著影响;(9)WB检测结果显示,MSC+latifolin高剂量组显著降低心肌组织中IL-6、p-NF-κB和HIF-1α蛋白表达,显著升高β-catenin蛋白表达。结论:采用全骨髓提取法获得的细胞为纯度较高的BM-MSCs,降香新黄酮latifolin通过改变炎症微环境显著提高BM-MSCs生存率,latifolin显著促进BM-MSCs向心肌细胞分化,latifolin显著促进BM-MSCs修复受损心肌细胞;经动物实验证实,latifolin通过降低炎性巨噬细胞浸润改善心肌组织中炎性微环境,显著提高在体BM-MSCs移植生存率和心肌细胞分化率,使受损心肌组织明显得到修复,latifolin有效增强BM-MSCs移植治疗心肌梗死效果,其作用机制可能与HIF-1α/NF-κB/β-catenin通路有关。