我国是咖啡因生产和消费大国,咖啡因及N-甲基黄嘌呤常用作食品和药品。通过微生物／酶法生产或降解相关N-甲基黄嘌呤,获得高附加值产物,在医药卫生领域具有广阔的应用前景。目前,咖啡因可降解菌株的种类较少。筛选高效咖啡因降解菌株并克隆其相关基因,将为开发微生物降解咖啡因技术,解决相关领域因应用咖啡因带来的日益严重的环境与健康问题,奠定基础。本论文的主要内容如下：1.以咖啡因为单一碳氮源筛选降解菌株,成功鉴定两株,分别为恶臭假单胞杆菌(ECUST5-2)与铜绿假单胞杆菌(ECUST2-3、新菌种)。两菌在含1.2g L-1咖啡因的培养条件下降解率分别达到0.039g h-1与0.024g h-1。HPLC分析显示,两种菌株均采用脱甲基化途径降解咖啡因。2.经反复驯化培养,成功获得了耐受高浓度咖啡因的降解菌株；利用响应面法优化了ECUST5-2与ECUST2-3的促咖啡因降解的培养基组分。优化结果表明,影响ECUST5-2降解率的主要因素为咖啡因、磷酸氢二钠、硫酸镁和酵母粉；影响ECUST2-3降解率的主要因素为磷酸氢二钠与氯化钙。优化条件下,ECUST5-2与ECUST2-3对咖啡因的降解率较原始条件分别提高了3.28倍和22.67倍。3.采用简并扩增和染色体步移技术相互结合的方法迅速获得了Pseudomonas putida ECUST5-2咖啡因脱甲基酶基因ndmA与ndmB序列全长,在此基础上成功获取ndmCD全长；将降解咖啡因的关键基因克隆并构建至pET表达载体上,成功表达目标蛋白。