神经胶质细胞是神经系统的重要组成部分,直接影响神经元的发育和功能。然而目前已有的研究结果多来自离体培养的细胞和脑片,在体研究十分缺乏。因此,在体条件下神经胶质细胞对理化刺激有何实时的响应,这种响应对神经元功能、感觉生成和行为有何意义和影响,及其分子细胞机制,都很不清晰。此外,在体条件下,神经胶质细胞自身的发育和突起定向生长的分子机制也很不明确。在本课题中,我们联合采用光遗传学、在体膜片钳电生理记录、在体胞内钙成像检测,结合分子生物学、遗传学筛选和行为学分析等方法,基于秀丽线虫(C.elegans)在体研究体系,探讨了以下问题：1)AMsh胶质细胞对理化刺激的响应及其分子机制；2)CEPsh胶质细胞发育关键因子的遗传学筛选。我们发现机械、化学因素刺激线虫鼻尖部位,均可以引起线虫AMsh胶质细胞的钙升高。嗅觉气味分子IAA刺激下,AMsh胶质细胞的钙响应表现为一个快速的升高相,大约1分钟以后钙水平开始下降,但随后钙又上升形成持久的第二相响应。相对于神经元,这种钙升高延迟时间更长,维持时间也更为持久,提示AMsh胶质细胞可能主要参与感觉调制,如适应性和神经可塑性等生理过程。我们发现,IP3受体介导的ER内钙库释放,是AMsh胶质快速相的主要成因,而L-型电压依赖性钙通道突变体(egl-19)中,钙升高也受到一定程度的抑制。在神经递质和神经肽分泌缺陷的遗传品系中,AMsh胶质细胞的钙升高程度降低,表明味／嗅觉化学受体神经元的激活,可以间接导致AMsh胶质细胞的钙升高。机械刺激线虫鼻尖部位,除了能记录到机械受体神经元ASH的响应电流之外,还能记录到阈值更低、幅值更大、失活更慢的AMsh胶质细胞的电生理响应电流。由于AMsh胶质细胞与ASH神经元有结构上的联系,我们探讨了机械刺激先激活ASH神经元,然后ASH神经元再激活AMsh胶质细胞的可能性。我们发现神经递质和神经肽释放缺陷的突变体中,AMsh胶质细胞对机械刺激的电生理响应完全正常。以Amiloride阻断ASH神经元对机械刺激的响应,AMsh的电生理响应仍然正常。在几种已知的机械敏感通道突变体(trp-4, deg-1, mec-4突变体)中,AMsh对机械刺激的电生理响应也是正常的。这些实验表明,ASH神经元的激活,不是机械刺激引起AMsh胶质细胞电生理响应的原因,AMsh胶质细胞可能本身就是一种机械受体细胞,能够直接对机械刺激作出响应。这种响应具体由什么机械敏感通道介导,需要进一步以正反向遗传学筛选等方法鉴定。我们应用光遗传学方法特异性激活CEPsh胶质细胞后,发现线虫后退的频率明显增加,表明胶质细胞的激活可能会影响到神经环路和行为。其机制也是我们下一步研究的重点内容之一。我们采用EMS正向遗传学筛选,得到了一批影响CEPsh胶质细胞和CEP神经元发育和突起定位异常的突变体。通过SNP mapping和基因测序等方法,我们发现突变体zuml是vab-3基因缺陷型的品系。文献表明vab-3在高等动物上的同源基因PAX6已被证实能影响少突胶质细胞的发育。下一步我们将研究其具体分子机制,并筛选鉴定更多的关键基因。本课题成功地建立了一个在体研究神经元--神经胶质细胞相互作用机制的实验技术平台,能够从“分子--细胞--环路--行为”各水平系统性地探讨胶质细胞的在体功能,以及胶质递质对神经传递、神经可塑性、感觉生成和行为的影响和其核心机制,进而为癫痫、抑郁症、神经退行性疾病等相关神经精神疾病的诊断与治疗创造理论条件。同时,我们依托于此平台,初步揭示了AMsh胶质细胞对理化刺激的钙信号和电生理响应的特点,探讨了其分子机制。