论文部分内容阅读
本研究分别从生理和分子两个方面探究了转PEPC基因水稻的优势C4光合途径,得出的主要结论有：1为了明确原种水稻Kitaake(简称为WT)和以其为受体的转玉米PEPC基因水稻(简称为PC)中C4光合途径的存在与否,并初步确定其优势C4途径,分别用浓度为200μ mol/L的天门冬氨酸(ASP)、L-苹果酸(L-MA)、ATP及100μmol/L的磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)对两种水稻幼苗的叶片进行处理,对照组用等量的H2O代替,测定两种水稻的光合放氧速率及各种C4光合酶的活性。实验结果显示,外源提供以上物质时,两种水稻光合放氧速率均提高,而饲喂ASP时提高幅度最大。测定各C4酶的活性发现,PEPC酶在PC水稻中的活性为WT中的9.81倍,外源PEP处理后,两种水稻中PEPC酶活性均增强；PEP羧激酶(PEP-CK)酶活性在PC水稻中也显著提高,为WT中酶活性的5.7倍。外源ASP处理后,PC中酶活性达到WT的6.16倍；依赖NADP的苹果酸酶(NADP-ME)在PC中仅比WT中高18.42%,且外源饲喂MA后酶活性在两种水稻中均上升；依赖NAD的苹果酸酶(NAD-ME)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)在转基因水稻中的活性均较低,分别比WT中相应酶活性低20%和24.2%。由此得出结论：在两种水稻中都存在完整的微弱C4光合循环途径,可以初步推测转基因水稻(PC)中优势C4途径为PEP-CK途径。2为了进一步明确PC的优势C4途径,应用半定量RT-PCR技术、荧光定量PCR (QRT-PCR)对两种水稻中各C4酶基因的表达量进行检测,最终用蛋白免疫印迹法(Western-Blot)对部分C4酶的蛋白表达量进行测定。半定量RT-PCR结果显示两种水稻中均可以检测到C4酶基因表达条带,PEPC基因在PC中表达量显著大于WT中,NADP-ME基因在WT中表达量高于PC中的表达量,而PPDK酶基因在两种水稻中表达量均较低。QRT-PCR结果显示PC中的PEPC酶基因、PEP-CK基因以及NAD-ME基因的表达量分别为WT中表达量的17倍、2.07倍及1.58倍,但是PPDK酶基因在PC中表达量比在WT中降低18.4%。对PEPC酶、PEP-CK酶、NADP-ME酶蛋白的Western-blot检测结果与酶活性检测、QRT-PCR检测结果一致,PC中三种酶蛋白量显著多于WT。定量分析结果显示,PEPC、NADP-ME、PEP-CK三种酶蛋白在PC中的含量分别是WT中含量的2.59倍、1.34倍和1.489倍。总的来说,两种水稻中均存在完整的C4光合微循环,PC中C4循环较强,这与其高C4酶活性密切相关,而其较高的基因表达水平及蛋白含量为其高酶活性提供了保证。结合酶活性、基因表达及蛋白含量的结果,得出结论：相比较而言,转基因水稻中优势C4途径为PEP-CK途径,其次为NADP-ME和NAD-ME途径。