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目的:胚胎心脏收缩功能的正常发挥对胚胎的存活至关重要,理解心肌细胞分化过程中的功能调控机制具有重要意义。本论文的目的在于:⑴定量分析心肌细胞肌膜上和肌浆网(Sarcoplasmic Reticulum,SR)上的Ca2+清除元件在心肌细胞分化过程中对钙稳态的贡献;⑵确定钙库调控的钙通道(store-operated Ca2+ channels,SOCC)是否参与调控分化期间心肌细胞的自律性;⑶探讨细胞骨架蛋白palladin对胚胎心肌细胞电生理性质的影响。
方法:本论文采用小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES cells)向心肌细胞分化的体外模型。用荧光指示剂记录钙瞬变。利用药理学和分子生物学方法检测了SOCC和典型瞬时受体电位通道(Transient receptor potential canonical,TRPC)家族在胚胎干细胞分化的心肌细胞(ES cells-derived cardiomyocytes,ESCMs)中的存在,及其对心肌细胞自律性的影响。应用基因剔除palladin小鼠模型,结合电生理技术,研究了palladin对胚胎心肌细胞电生理特性的影响。
结果:⑴在心肌细胞分化早期,SR上的钙泵(Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ATPase,SERCA)已承担了大部分Ca2+清除任务,其贡献随着细胞分化而逐渐增大。而细胞膜上的钠钙交换体(Na+/Ca2+ exchanger,NCX)对Ca2+清除的贡献比例则随着分化逐渐减少,且主要在钙瞬变衰减相末期发挥作用。这一结果揭示了SR对分化中的心肌细胞钙稳态调控的重要性。⑵SOCC及其候选编码蛋白TRPC家族在ESCMs中存在。SOCC和TRPC的抑制剂skf96365和激动剂OAG可以分别抑制或促进ESCMs的自律性钙瞬变的发生。⑶palladin缺失导致胚胎心肌细胞L型钙电流显著增强,动作电位时程明显变大。
结论:①心肌细胞分化过程中,SR在钙稳态的维持中发挥重要作用。②SOCC及其组分TRPC家族通道可能参与了ESCMs自律性的调控。③细胞骨架蛋白palladin参与维持胚胎心肌细胞的电生理活动。这些研究对于理解分化发育过程中心肌细胞的钙稳态,自律性和电生理性质提供了新的信息。