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铜是一种人体必需微量元素,铜缺乏和过量都会引起不良的健康效应?对于健康非职业性铜暴露人群,经口摄入是铜的主要摄入途径?人体和动物实验研究表明,消化道是铜暴露敏感的效应靶器官,但其可能的细胞和分子生物作用机制还不清楚?此外,现有的经口铜毒性资料多为经饲料或一次灌胃暴露的动物资料,尚缺乏由饮水铜暴露导致的较为全面的毒性和代谢影响研究?本文分别利用体外和动物实验,以研究铜的肠道粘膜上皮细胞的毒性和经饮水铜暴露对大鼠各靶器官?组织铜浓度和 MT 基因表达的影响? 体外实验以 Caco-2 细胞为模型,观察在不同的暴露场景下铜对肠道粘膜上皮细胞的毒性?功能影响及其可能作用机制?结果表明:1)铜可显著促进细胞内活性氧自由基的产生,使细胞活力,细胞增殖能力和克隆形成能力降低,表现出一定的细胞毒性;2)由于分化 Caco-2 细胞单层的细胞极性特征,细胞单层顶侧较底侧对铜的毒性更为耐受;3)细胞单层顶侧面铜暴露(30 μM～100 μM,Hanks 缓冲溶液,0～3 h)可引起细胞内微丝解聚,从而导致细胞单层 TEER 值呈浓度和时间依赖性降低,但对紧密连接蛋白 ZO-1 无显著影响;4)在不影响细胞活性和通透性的剂量下,顶侧面铜暴露(300 μM,完全培养基,24 h)还可显著增加 Rho-123 从顶侧到基底侧,降低基底侧到顶侧方向的转运,同时还可显著增加细胞内 Rho-123 的蓄积,5)铜暴露可引起细胞内 Rho-123 呈时间和浓度依赖性蓄积增加;6) 铜暴露可显著诱导 Caco-2 细胞 MT-2A 基因 mRNA 的转录,而对 MDR1 和 Ctr1 基因 mRNA 转录水平无明显影响?总之,铜暴露可引起Caco-2 细胞活性和细胞增殖能力下降,可导致细胞单层通透性增加和分化细胞刷状缘膜面 P-糖蛋白(P-gp)活性下降,从而引起细胞单层屏障功能下降,铜可诱导细胞 MT-2A 基因转录,增加 MT 表达,参与铜解毒和吸收调节?结果提示,Caco-2 细胞单层通透性和 P-gp 活性的改变可敏感地反映铜对肠道粘膜上皮细胞的影响,并可能用来反映其它外来化学物肠道粘膜上皮细胞毒性的指标? 动物实验以雄性 SD 大鼠为模型,研究饮水铜暴露 14 天对大鼠各靶器官组织病理?临床病理?组织铜含量和 MT 基因转录和表达的影响,各组饮水中 CuSO4浓度分别为 0?100?300?1000 ppm,各组估计摄入剂量分别为 0?6.4?18.8 和49.9 mg Cu/kg bw/day?结果表明:1)在 1000 ppm 组,大鼠饮水量显著下降,动物体重增长也明显减缓(为对照组体重增长量的 75.2%),但摄食量下降和饮水量降低可能是导致该组大鼠体重增长缓慢的主要原因,而不是由于铜的特异毒作用结果;2)饮水中 CuSO4浓度自 300 ppm 起,可显著引起肝脏和肾脏中铜浓 1<WP=6>复旦大学博士学位论文 铜的肠道上皮细胞毒性和对大鼠的亚急性毒性研究度增加?对照组中肝脏铜浓度为 2.45±0.23 mg/kg 湿重,1000 ppm组大鼠肝脏中铜的浓度升高至 18.12±9.19 mg/kg 湿重 (10.40～31.06 mg/kg 湿重),而在停止染毒 7 天后,该组大鼠肝脏中的铜浓度为 17.98±12.56 mg/kg 湿重,未见显著下降?结果提示,饮水中 CuSO4浓度从 300 ppm 始,超过机体铜代谢平衡,从而导致体内铜蓄积增加,而蓄积在肝脏中铜在停止暴露后并不能在短期内排出体外?肾脏中铜浓度自 300 ppm始也较对照组显著升高,但与暴露剂量之间无明显剂量-反应关系;3) 饮水中 CuSO4浓度自 300 ppm 起肝脏和肾脏中 MT 表达显著增加,但 MT 在肝脏中的分布仅限于门管区周围的肝细胞,在肾脏则仅分布于肾皮质部,主要位于近曲小管上皮细胞中,组织中 MT 表达强度和该组织中铜的浓度间存在一定的正相关?由于过量的铜主要以 Cu-MT 的形式存在于肝脏和肾脏中,提示铜在肝脏和肾脏也主要蓄积在 MT 表达较多的细胞中,而并非均匀弥漫地分布在这些组织的所有细胞中?各暴露组血清铜浓度和对照组比较略有升高,但统计学上无显著性差异(P>0.05)?这是由于铜经饮水进入体内是一个缓慢持续的过程,不会引起血清铜浓度急剧升高,加之新吸收入血的铜会很快沉积在肝脏,在进入机体的铜不超过肝脏的结合能力时,不会引起血清铜水平显著升高?相关组织病理和临床生化指标检测在各组均未发现明显的胃?肝脏和肾脏损伤?但由于蓄积在肝肾组织中过量的铜不能在短期内排出体外,那么是否由此会引起一定的长期健康效应还有待进一步研究?总之,在此暴露条件下,铜可引起肝脏中铜的蓄积和 MT 表达增加;若以肝脏中铜含量升高作为效应终点,未观察到效应水平(NOEL)则为 6.4 mg Cu/kg bw/day?结果还提示肝脏组织中铜浓度或 MT 表达强度可在一定程度上反映大鼠铜暴露水平,而在此暴露场景下,血清铜浓度并不是一个敏感的铜暴露标志物? 此外我们对 1980 年迄今中国发表的有关铜健康效应研究的文献资料进行了全面的检索?收集?阅读和综述,完成了"Studies on Copper-Related Health Effects in China - A Critical Review"?该评论性综述填补了国际铜业协会在"铜与健康相关研究资料库"中我国资料的空白,并为未来中国人群铜的健康危险度评价提供基础资料?