尽管近十年来肿瘤基因治疗在实验动物中取得巨大进展，但其临床研究进展仍十分缓慢，其主要障碍是传统的基因治疗方案采用非增殖病毒或物理化学方法，这种方案基因转染率低、表达量低，对肿瘤细胞不能靶向治疗，从而达不到治愈肿瘤的目的。最近，一种肿瘤细胞特异性增殖型病毒治疗方案在肿瘤治疗上取得了重要进展，它利用肿瘤细胞与正常细胞的某种差 异，如P53基因突变与否， 使病毒在肿瘤细胞中特异性增殖，而在正常细胞内不增殖，从而特异性杀灭肿瘤细胞，如图1。其中最引人注目的肿瘤特异性 增殖型病毒是美国ONYX 药物公司研究的E1b55Kda缺陷的增殖型腺病毒（ONYX－015）。应用于两 图 10NYX－015在肿瘤细胞内特异性增殖组常规疗法均无效的头颈部肿瘤患者身上，结果有1／3的病人肿瘤缩小了50％，在与化疗结合使用的十个病人中有两个肿瘤完全消退，7个缩小50％以上，这是至今为止应用于临床的最有效的生物治疗。为此我们设想应用这种肿瘤特异性增殖型腺病毒携带某种对肿瘤治疗有明确疗效的抗癌基因，利用病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制，而在正常细胞内不增殖，从而使抗癌基因在肿瘤细胞内特异性高效表达，如图2。这种结合病毒治疗与基因治疗优点的新型治疗方案称为基因病毒治疗法。它克服了传统基因治疗转染率低、表达量少及靶向性弱等缺点。 3第二军医大学 中 文 摘 要 博士学位论文倍，对于HT29则可增殖数—，－MeWWeqffngtlNps）ec－’－－－－M千至数万倍，对于SW620、＿＿”＿囚冈回匕释踞婉篷；凿 辟则可增殖数十万至百万——－”、、。 赖掺贿滋酚沈问阀回键羽用回翻倍。对于同一种大肠癌细－’－M大憋人店溯圃辫 一j凶酪胞，ONYX－015增殖作用明’穆巅踢广＼摔刀回阑回口口回蹈憋显强于＊h几－12，可能与。、—。；。＿：＿＿一鹰褡《翘酚y赡回圈囫口回回回回邀蹬Mh几－12中n区病毒基－”，－－．：＿＿风脉缀廖 憾圆回回回口回口回回圈回因缺失有关。Ad’mILIH．。A回勋稻颖额、一。回回团口口回回回回回回在三种大肠癌细胞中均有＿＿＿＿＿酚圈幽翻濒镶酚＼耀工圃蹬瞪回愚缀回m憾上大量IL－12 蛋白表达。＿＿。、。＿＿、＿WHtasNwrs－－－－ruH－－－－HT29、SW620细胞培养上 刃圃圈械濒圃趟圃n卜措瞧酸攀毅炒－－了＼飞鞠清蛋白表达量明显高于 一一澜髓圈圈猫圃圃凶回回回圃螂d7e，＿＿＿06细胞。兔疫组化和电 图；病毒在盯”大。肿瘤细胞核内大量复制（UXI。皿〕镜检查证明Ad’mIL－12在人大肠癌细胞中确实能够完成正常增殖周期，能脱壳进入细胞核并大量复制，能使目的基因在肿瘤细胞内大量拷贝；如图3。 3．肿瘤特异性增殖型腺病毒携带mIL－12基因治疗大肠癌的体内实验研究 ONYX－015对BALB／C小鼠C26大肠肿瘤有较弱的治疗作用，使肿瘤生长减缓；对于应用人的大肠癌细胞株HT29、SW620建立的荷瘤裸鼠有一定的治疗作用，肿瘤生长明显减慢。肿瘤特异性增殖型腺病毒载体携带IL－12基因可使基因在人大肠癌动物模型中大量扩增，外周血 IL－12蛋白表达量数千倍提高。在 BALB／C小鼠大肠癌模型中增殖力较弱，但IL－12蛋白表达也明显增高。三组动物实验组以荷C26大肠癌的BALB／C小鼠治疗效果最好，在高剂量治疗组达到肿瘤全部消退。肿瘤特异性增殖型腺病毒载体携带几－12基因治疗大肠癌可产生双重协调作用，发挥病毒扩增杀伤肿瘤细胞作用，IL－12则可调控机体免疫功能。在BALB／C小鼠大肠癌模型中，主要治疗作用源于几－12。在裸鼠大肠癌模型中，治疗作用是病毒扩增杀伤和几－12蛋白抗肿瘤双重作用，但由于T淋巴细胞缺陷，IL－12调节免疫功能不能充分发挥。如果应用于人体大肠癌的治疗，病毒治疗和几－12治疗将同时充分发挥作用。肿瘤特异性增殖型腺病毒载体携带几－12基因治疗仍然不能完全达到靶向性基因治疗效果，高滴度治疗则有严重副作用，因而有必要进一步进行基因表达的调控研究。 5第］军医大学 中 文摘要 I4十学位论文 一 本研究成果和结论如下： 1．完成mIL刁 融合基因的构伎 完成肿瘤特异性增殖型腺病毒载体的构建。 2 完成肿瘤特异性增殖型腺病毒携带mIL－12基回即Ad’mIL－12的重组。 3．体外实验表明Ad’m1L－12对大肠肿瘤细胞感染力、增殖能力、杀伤力均较 ONYX－015稍弱，可能与Ad’mIL－12中 E3区病毒基因缺失有关。 4．体外实验证明Ad’m1L－12在人的大肠癌细胞中能够大量复制，增殖可达百 万倍，mIL－12蛋白表达量可提嵩上干倍。增殖型腺病毒载体系统类似于体 内工厂，能大量提高蛋白表达量。 5．体内实?