研究背景及目的意义平、战时军事作业与日常生活中常发生烧(创)伤,严重烧伤发生的烧伤休克,以及严重创伤导致的失血性休克,均可导致严重的心肌缺氧损害。大量的临床实践表明,与平原比较,高原低氧环境下烧伤休克和创伤失血性休克所致心脏等重要脏器缺氧性损害明显加重。心脏作为循环动力器官,严重的心脏损伤将进一步减少机体氧供,加重全身其他组织器官损伤,增加严重创伤和烧伤休克死亡率与总体死亡率[1,2],严重影响进驻高原地区部队的战斗力和人民群众的身体健康。因此,探讨高原低氧条件下缺氧性器官损伤特别是心脏损伤这一重大科学问题,对保障进驻高原地区居民和部队的健康和战斗力,乃至实现我国新时期的国防战略目标均具有重大意义。高原低氧条件下缺氧性心肌损害的发生规律与调控机制尚不清楚。在生理条件下,自噬指细胞经溶酶体系统降解长寿命蛋白与老化受损的细胞器以维持细胞正常功能的一种现象,整个自噬过程称为自噬流,当自噬流通畅可为组织细胞供能和解毒,以保障细胞新陈代谢等生命活动的顺利完成。因而,完整的自噬过程对细胞在缺血缺氧等应激条件下维持正常的生理功能至关重要。然而,许多病理因素可引起细胞自噬流受损,并由此导致细胞死亡与功能障碍[3,4]。既往发现,低氧等应激可损伤细胞自噬过程,并进一步促进、放大凋亡和坏死等病理损害[5]。既往研究发现,单纯烧伤因休克缺氧可引起心肌自噬体增多,是心肌损伤和功能降低的重要因素[6]。由此提示,高原低氧条件下心肌缺氧可能通过损伤细胞自噬流加重心肌损害。但是,高原环境下缺氧心肌自噬流受损的机制尚不清楚,本课题对此开展了研究。缺氧心肌细胞中介导自噬流受损的因素尚不清楚。已有研究表明溶酶体的酸化在介导自噬体与溶酶体融合、激活溶酶体酶并促进底物降解中发挥重要作用,是调控自噬流的关键环节。氯化铵或氯喹可中和溶酶体的酸化,显著阻止自噬体与溶酶体的融合,损害自噬流[7]。在溶酶体酸化过程中,离子通道和质子泵对维持溶酶体腔内的酸性环境起重要作用。其中,V-ATPase是一种p H敏感的质子转运蛋白,通过不可逆地水解ATP驱动胞浆内的H+进入溶酶体,使其酸化,因此,V-ATPase是调控溶酶体酸化的关键途径。但迄今为止,这种调控机制仍未完全阐明[8]。我们认为,自噬流受损是介导高原低氧环境下缺氧心肌损伤的重要因素,抑制溶酶体膜上的质子泵V-ATPase能抑制溶酶体的有效酸化。综上,我们推测严重烧伤引起溶酶体V-ATPase活性下降是高原低氧环境下缺氧心肌自噬流受损的关键分子机制。为证实上述假设,本研究模拟高原低氧环境,制备高原低氧、严重烧伤以及高原低氧复合严重烧伤模型,从整体动物层次明确心肌溶酶体V-ATPase活性下降在缺氧引起自噬流受损中的重要作用。通过研究,可望证实“高原烧伤-溶酶体V-ATPase活性下降-自噬流受损-心肌损害”这一新途径在高原低氧环境下缺氧心肌自噬流受损中的关键作用,进一步深化缺氧对重要器官损伤机制的认识,为高原低氧环境下缺氧心肌损伤乃至全身组织器官损伤的临床防治,提供重要的理论依据。材料和方法1.平原和高原低氧严重烧伤模型的制备平原烫伤模型制备:取10只SD大鼠,背部脱毛后,常氧环境下采用88.8℃水浴35 s处理,造成背部约40%TBSA烫伤,制备平原烧伤模型(以下简称烧伤);高原烫伤模型制备:将10只SD大鼠置于高原5000 m低氧环境下对实验动物进行预处理12 h,于高原3000 m条件下采用88.8℃水浴35 s处理,造成背部约40%TBSA烫伤,然后迅即置于5000 m环境下观察,制备高原低氧复合严重烧伤模型(以下简称高原烧伤)。伤后24 h,各组大鼠取全层皮肤组织做病理切片,光学显微镜下观察组织形态结构。2.大鼠心肌损害、心肌自噬流及溶酶体V-ATPase活性检测大鼠血清心肌酶谱及肌钙蛋白T(c Tn T)采用试剂盒法;大鼠心肌自噬相关蛋白LC3和P62表达采用WB法。溶酶体V-ATPase活性检测采用酶偶联分析法。3.干预V-ATPase活性后V-ATPase、自噬流及心肌损害指标观测使用V-ATPase的激活剂(ATP)和抑制剂(巴弗洛霉素)后,采用电化学法发光免疫法检测c Tn T,速率法检测心肌酶谱,采用WB法检测大鼠心肌自噬相关蛋白LC3和P62表达,采用酶偶联分析法检测溶酶体V-ATPase活性。4.高原低氧环境严重烧伤后,大鼠心肌损害及自噬流的检测高原烧伤大鼠在5000 m环境观察24 h后,取血分离血清,采用电化学法发光免疫法检测c Tn T,速率法检测心肌酶谱心肌肌钙蛋白T含量;取大鼠心脏组织提蛋白,利用WB技术检测心肌LC3和P62的表达。结果1.平原和高原严重烧伤模型的建立在常氧和模拟高原5000 m环境严重烧伤后24 h,大鼠皮肤组织疏松,结构紊乱,基底膜断裂失去连续性,真皮乳头层水肿,网状层胶原纤维断裂,毛囊破坏,方向改变,皮下组织肿胀坏死,肌纤维断裂,均为三度烧伤的典型表现,说明模型建立成功。2.常氧环境严重烧伤后心肌损害情况、心肌组织自噬流改变及V-ATPase活性的变化正常对照组血清中的c Tn T、AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB含量分别为(2.2±0.4)μg/L、(100.7±5.1)IU/L、(484.3±76.5)IU/L、(183.9±24.3)IU/L、(340.5±41.9)IU/L、(485.9±45.6)IU/L,烧伤组血清中上述指标含量均明显升高,分别为(4.3±0.38)μg/L、(1112.0±51.6)IU/L、(2174.0±201.3)IU/L、(833.1±52.8)IU/L、(1304.0±184.3)IU/L、(1004.0±54.0)IU/L(P值均小于0.05)。与正常对照组比较,烧伤大鼠心肌组织LC3、P62表达水平明显升高。与正常对照组心肌组织溶酶体V-ATPase活性的(6.17±0.22)μmol/protein(mg)/h比较,烧伤组大鼠V-ATPase活性明显下降,为(2.44±0.33)μmol/protein(mg)/h(P<0.05)。3.调控V-ATPase活性对常氧环境烧伤大鼠V-ATPase、自噬流及心肌损害指标的影响正常对照组V-ATPase活性为(4.15±0.47)μmol/protein(mg)/h,巴弗洛霉素处理后大鼠V-ATPase活性下降至(1.93±0.56)μmol/protein(mg)/h(P<0.05);与烧伤组大鼠的(2.03±0.67)μmol/protein(mg)/h比较,ATP组大鼠V-ATPase活性明显上升,为(2.87±0.70)μmol/protein(mg)/h(P<0.05)。与正常对照组比较,巴弗洛霉素处理后大鼠自噬流受损;与烧伤组大鼠比较,烧伤后ATP处理则可使大鼠自噬流受损程度明显减轻。与正常对照组比较,巴弗洛霉素组大鼠血清中的c Tn T、AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB含量均明显升高(P值均小于0.05);与烧伤组比较,ATP组大鼠血清中的上述指标含量显著下降(P值均小于0.05)。4.高原低氧环境严重烧伤对心肌损害和心肌自噬流的影响高原低氧组(简称高原组)血清心肌损伤指标c Tn T、AST、LDH、α-HBDH、CK、CK-MB含量均显著高于平原正常对照组(P值均小于0.05),高原烧伤组大鼠血清心肌损伤指标也显著高于常氧烧伤组(P值均小于0.05)。提示高原低氧环境下严重烧伤较常氧环境烧伤心肌损害更为严重。正常对照、高原组、烧伤组、高原烧伤组大鼠自噬相关蛋白LC3和P62的表达依次呈上升趋势,高原组大鼠LC3和P62表达显著高于正常对照组,高原烧伤组大鼠LC3和P62显著高于平原烧伤组,提示高原低氧环境下严重烧伤较常氧环境烧伤心肌自噬流受损更为严重。结论1.成功构建了高原大鼠全层皮肤三度烫伤模型,组织学检查证实为典型三度烫伤,说明建模成功。2.常氧环境严重烧伤后24 h可导致心肌显著受损和自噬流障碍。严重烧伤通过抑制心肌溶酶体V-ATPase活性导致心肌自噬流受损是心肌损害的重要机制之一。3.无论是高原低氧环境还是常氧环境,烧伤大鼠均发生心肌损害和自噬流受损,自噬体累积,但高原低氧环境严重烧伤较常氧环境严重烧伤心肌损害和自噬流受损更为严重。