苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种安全高效的农业杀虫微生物,在害虫防治领域有着广泛的应用,其活性物质主要是杀虫晶体蛋白(Cry蛋白);目前将Cry蛋白基因转入植物,培育抗虫转基因植株是生物防治有效手段之一。　　 本研究将实验室已有的两个高效杀虫蛋白基因cry7Ca和crylAc进行基因改造,通过种子诱导愈伤,进而培育Bt转基因水稻,从而验证两类cry基因在水稻中的功能。　　 研究的第一部分内容是利用实验室自主克隆的杀蝗虫晶体蛋白基因cry7Ca1,在保证原有蛋白氨基酸序列的前提下,根据水稻密码子的偏好性,进行基因优化,将序列的GC含量提高到43.6%,去除潜在影响mRNA结构稳定的序列,并在改造的cry7Ca1前后端添加有利于基因在水稻中表达的前导序列及终止识别序列,最终合成了全长为2386 bp的Mcry7Ca1序列,该序列与原始基因保持了85%的同源性。将改造前后的基因cry7Ca1和Mcry7Ca1分别构建原核表达重组质粒pQE-M7Ca1和pQE-7Ca1。在大肠杆菌中两基因诱导表达的条件基本一致,并且都是以包涵体的形式表达;通过SDS-PAGE和Western blot检测,Mcry7Ca1和cry7Ca1,均在64kDa左右有明显条带,生物测定结果表明,改造后的MCry7Ca1在浓度为1.1493μg/mL时对蝗虫幼虫7天的校正死亡率为44.4%。由于该基因是根据真核生物的偏好性进行的改造,故改造后基因的原核表达水平发生了明显下调,约为改造前水平的14%。经过原核表达检测正确后,将改造前后的cry7Ca1分别插入真核表达载体p1302-35S-nosA中,利用农杆菌侵染法转化水稻中花11的愈伤组织,成功获得了44株cry7Ca1和11株Mcry7Ca1PCR阳性的转基因植株,经过RT-PCR检测仍为阳性的转基因植株分别为7株和11株,通过Western blot检测进一步验证了改造前后cry7Ca1 RT-PCR检测呈阳性的转基因水稻中表达的正确性。将Mcry7Ca1转基因水稻生物活性测定,结果显示蝗蝻校正死亡率达到77.7%。　　 第二部分研究是以实验室已经构建好能有效提高crylAc杀虫活性的crylAc/Enhancin4融合基因作为研究对象,分别将cry1Ac/Enhancin4和cry1Ac通过重新设计引物加上合适的酶切位点后将其插入真核表达载体p1302-35S-nosA中,然后转化水稻愈伤,获得转基因植株,并对融合基因cry1Ac/Enhancin4进行功能验证。目前通过cry1Ac/enhancin4转化,共得到转基因植株6颗。