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肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种骨骼肌生长负调控因子,敲除MSTN基因能够促进肌肉生长,使动物呈现“双肌”表型。本研究目的是应用CRISPR/Cas9基因编辑技术和近交或回交法培育MSTN基因突变纯合子家兔。虽然应用CRISPR/Cas9等基因编辑技术制备MSTN基因突变兔已有报道,但几乎没有基因编辑哺乳动物培育纯合子后代的报道。本研究旨在建立基因编辑的突变家畜培育纯合子的技术平台,并且探明MSTN基因突变兔纯合子后代的表型特征与原代突变兔是否保持一致,以及对MSTN基因突变兔后代的繁殖性能、脱靶机率等生物安全性评价。本研究设计了针对兔MSTN基因组（NCBI:NC013675.1）第3外显子半胱氨酸结位点的 CRISPR/Cas9 引导序列（gRNA1 和 sgRNA2）,sgRNA1 靶位点:5615-5639,sgRNA2靶位点:5532-5554。sgRNA和Cas9 mRNA用于受精卵显微注射,制备原代MSTN基因编辑兔;以出生仔兔基因组DNA为模板PCR扩增,DNA扩增产物序列测定、比较分析和序列峰图解析,筛选出原代MSTN基因突变兔。选择“双肌”表型明显,同时DNA缺失最少的MSTN基因突变原代兔M2（♂）、M3（♀）和M7（♂）为亲本,与野生型兔配种,或原代公兔母兔配种,繁殖F1代半合子或杂合子突变兔。半合子突变兔同胞、半同胞交配或回交,获得F2代突变兔,经PCR检测和序列分析,筛选出纯合子兔。PCR产物插入T载体和挑选单克隆菌落,测序和序列分析进一步验证突变兔。对MSTN基因突变F1和F2代突变兔的生产性能评估包括:（1）MSTN基因突变兔增重率:14～19周龄的F1和F2代MSTN基因突变兔、同品种同年龄的野生型兔每周测量体重,并计算体重增长率;（2）比较突变兔和野生型兔体形体态和酮体形态评判肌肉丰满度;（3）骨骼肌纤维横截面积比较:活体取同年龄纯合子、半合子和野生型臀大肌组织块,显微观察石腊包埋切片,应用Image Pro Plus 6.0软件分析比较肌纤维横截面积;（4）繁殖性能（配种受胎率、产仔数、仔兔初生窝重和仔兔断奶窝重）评价;（5）利用石蜡和免疫组化检测肌纤维中MSTN基因转录水平。安全评价包括:（1）脱靶检测:根据sgRNA-1和sgRNA-2序列,在线网站共筛选潜在脱靶位点,依此设计PCR引物,以突变兔基因组DNA为模板进行扩增和产物测序比对;（2）生理生化检测:血液常规和生化检测;（3）舌形态和体积,舌肌组织切片,牙齿、腰椎、骨盆的X线侧位摄片用于生物安全评价。试验结果:胚胎移植受体兔产仔兔7只,检测出5只MSTN基因突变兔,突变型结构如下:M1:NC013675.1:g.[54935651del CATCTT----TGAGAT;5492T＞A];[54695637delCACCC---CTGT G],p.[H325-S375delinsDLHLVFNFLKHGRSSPQQFfs*];[F317S375delinsGAHEICI WFLTS fs*];M2:NC013675.1:g.[55945645delAATAAT----TGCT CA];[56326533 delinsA];p.[Q358S375delinsHEICIWFLTS;0];[R371S375delinsHVGAHEICI W;fs*];M3:NC013675.1:g.[56275636delAGACCGCTGT];[56375638insCTCATG T],p.[D 368S375delins:GAHEI CIWFLTS];[371375delins:RCGCS;0];M4:无突变;M5:NC013675.1:g.[53895524delTT GAAG----GAGGTTC;5629G＞C;5530G＞T;5533C＞T;5537 C＞T;5538 T＞A],p.[290 fs*];M6:无突变;M7:NC013675.1:g.[55395540 ins CT];[5539-5540insT],p.[C340C375 delinsSVLPQRCLQLICYILMAKNK;fs*];[340del:C;fs*]。总突变率为 71.4%（5/7,M1 ♀、M2♂、M3♀、M5♀、M7 ♂）,其中 M1、M2、M3、M5的靶点位于sgRNA1同源区,M7的靶位点是sgRNA2同源区。除M5为纯合突变外,其余4只突变兔均为双等位基因杂合突变,双等位基因编码的第309,340,372,374位半胱氨酸均有不同程度的缺失或置换,半胱氨酸删除率为100%。同一原代兔的两个突变体分别标记为“a”和“b”,突变兔繁育结果如下:M2:共繁殖F1代半合子突变兔4只:其中3只a型（p.[368375 delinsHEICIWFLTS;0]）,1只b型（p.[371375delinsHV GAHEICI W;fs*]）;F2代:8 只 a型半合子突变兔;4 只 b型半合子突变兔;5只纯合子突变兔（a型3只;b型2只）;M3:繁殖6只F1代半合子和杂合子突变兔,其中2只为a型杂合突变兔（p.[V368S375delinsGAHEICIWFLTS]）,4只为b型半合子突变（p.[371375delins:RCGCS;0]）;5只F2代a/M2-b型杂合子兔和7只F2代b型半合子,2只a型和2只b型纯合子突变兔;M7:繁殖10只F1代半合子突变兔,其中 6 只 a 型(p.[C340C375delins:SVLPQRCLQLICYILMAKNK;fs*],4 只b型号（p.[340del:C;fs*]）,10只F2代半合子突变兔,其中3只a型和7只b型半合子,6只F2代a型纯合子突变兔。共繁殖基因突变兔69只,其中有18只F1代半合子,2只F1代杂合子兔。共获得29只F2代半合子和15只纯合子突变兔,5个纯合子突变体。29只F2代半合子兔,5只杂合突变兔。纯合子突变兔14～19周龄的体重统计分析结果显示:突变纯合子兔的平均周增重明显高于野生型兔（35.77～39.42%）。43.5周龄成年突变兔体重（3806±55.36g）明显高于同龄期野生型兔（3054±80.82g,P＜0.01）,突变兔外形呈现典型“双肌臀”表型。突变兔进行肌肉组织学表型分析:MSTN-/-和MSTN+/-臀大肌肌纤维平均截面积分别为:3512.20±439.17μm2和 2610.37±604.44μm2,均明显高于MSTN+/+野生型兔（1274.76±327.30μm 2,P＜0.01和P＜0.05）。在肌纤维中的转录水平纯合子、半合子明显低于野生型,其中纯合子突变兔的含量最低。突变兔繁殖性能比较:原代突变公兔与野生型母兔的受孕率为90%;产仔数为3～10只,与父母本都是野生型的无明显差异（P＞0.05）。基因突变仔兔出生窝重和断奶仔兔窝重也无明显差异（突变型/野生型分别:37.14～54.75g/36～55.17g和165.24～380.25g/、206.42～348.4g,P＞0.05）。安全评价:（1）预测的10个潜在脱靶位点设计引物检测脱靶均未获得相应突变序列,未发现获得的基因突变体存在异位突变。（2）研究发现基因突变纯合子兔具有明显的牙齿咬合错位、大舌症及骨盆倾斜的现象,但不影响采食和配种繁殖。（3）10项血常规检验和12项生化检测结果显示:肌酸激酶（CK）、肌酐（CREA）、脂肪酶（LIP）这三项指标比野生型兔偏高,其余所有指标正常。综上结果表明,本研究成功地应用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备和培育了基因突变新西兰兔后代。经近交繁育获得了 5种基因突变纯合子。经14～19周龄阶段体重测定和屠宰胴体的比较和肌肉组织学分析,表明基因突变纯合子兔的生长速率和成年体重有明显提高,呈现明显的“双股臀”表型。突变母兔产仔数和仔兔窝重均与野生型无显著差异;通过脱靶、生化指标、骨骼X光和解剖学的检测分析和生物安全性评价,未发现有明显影响正常繁殖和生长发育的生物安全隐患。本研究应用基因编辑技术制备的双等位突变体亲本成功繁育纯合子,将家畜基因编辑育种或“反向分子设计育种”向前迈进了一步。