论文部分内容阅读
目的和意义:肝脏作为“机体代谢中心”,在物质代谢平衡维持中起到重要作用。胆固醇代谢紊乱是代谢综合征(metabolic syndrome,Met S)的一项重要临床表现。长链非编码RNAs(long non-coding RNA,lnc RNAs)调节机体胆固醇代谢的具体分子机制尚未阐明。本课题旨在研究胆固醇代谢过程中起关键调控作用的lnc RNA,明确该基因在胆固醇代谢过程中的作用及具体分子机制,以及影响该基因表达的上游调控机制。该研究将为胆固醇代谢和Met S的分子发病机制研究奠定坚实的理论和实验基础。研究方法:1.利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)建立高脂饮食诱导的Met S大鼠(high-fat diet induced metabolic syndrome,HFD-Met S)差异表达基因c DNA文库。随机挑选正向文库20个克隆进行测序、NCBI数据库比对,并用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)鉴定基因的表达水平。2.利用电子克隆和SMART RACE技术扩增未知片段EH05基因全长;利用生物信息学分析其编码潜能,包括对不同种属新基因同源核酸序列保守性分析、Kozak序列分析、同源序列的预测开放阅读框(ORF)保守性分析以及预测肽段与已有蛋白质肽段数据库比对;利用实验手段研究新基因编码潜能,将预测ORF与Flag和EGFP标签分别进行融合蛋白真核表达,检测融合蛋白的表达情况。最终将新基因命名为lnc-HC。3.利用Northern blotting技术明确lnc-HC与重叠蛋白质编码基因Slc25a15的关系,并在代谢紧密相关组织中检测lnc-HC的表达情况;进一步用PCR鉴定lnc-HC在大鼠肝组织不同亚细胞中的定位。4.用RNA干扰的方法构建lnc-HC高表达及敲低的CBRH-7919单克隆细胞稳定系,并检测胆固醇代谢关键分子在m RNA和蛋白质水平的表达改变。利用lnc-HC sh RNA载体干预高胆固醇饲料诱导的脂代谢紊乱大鼠模型,在体水平评价lnc-HC对胆固醇代谢指标的影响。5.利用RNA pull-down、RNA immunoprecipitation(RIP)和质谱(mass spectrum,MS)技术研究lnc-HC结合蛋白,阐明lnc-HC调控胆固醇代谢的具体分子机制。6.构建高胆固醇细胞模型,检测lnc-HC的表达;利用CRISPR/Cas9基因敲除及双荧光素酶报告基因系统分析lnc-HC的核心启动子区;利用生物信息学分析、重组体构建和双荧光素酶报告基因系统探索胆固醇上调lnc-HC的关键转录因子(transcription factor,TFs)及作用位点。7.利用LXRα激动剂处理CBRH-7919细胞,检测其对C/EBPβ以及lnc-HC的表达影响。研究结果:1.成功构建了HFD-Met S大鼠肝组织差异表达基因c DNA文库,正向文库中的9个已知基因和1个未知EST片段在HFD-Met S组中显著高表达。2.lnc-HC全长1,410 nt,生物信息学分析显示其种间保守性低、无Kozak序列、种间无保守ORF框且预测蛋白肽段在已知蛋白库中无匹配序列;融合蛋白表达实验结果显示,lnc-HC ORF不能表达蛋白质。3.lnc-HC是独立的转录本,与Slc25a15的表达无相关性;lnc-HC在肝脏、胰腺、脂肪和肌肉中均有表达;lnc-HC主要定位于肝细胞的细胞核。4.lnc-HC高表达后,Cyp7a1和Abca1的表达显著降低;lnc-HC敲低后,Cyp7a1和Abca1的表达显著升高。lnc-HC干扰组大鼠血清学指标显著恢复,糖耐量基本恢复正常水平。5.hn RNPA2B1是与lnc-HC直接结合的蛋白质,两者形成RNA-protein复合物并结合于靶基因Cyp7a1和Abca1的m RNAs上并改变其表达水平。6.lnc-HC的近端核心启动子区在转录起始位点(TSS)上游-1,000~-200 bp,胆固醇高调lnc-HC的表达是通过C/EBPβ结合于lnc-HC的近端核心启动子区所介导的。7.高浓度胆固醇通过激活LXRα继而上调活化C/EBPβ,进一步活化lnc-HC的转录。结论:1.lnc-HC是在HFD-Met S肝组织中高表达的一例新长链非编码RNA。2.lnc-HC通过与RNA剪接蛋白hn RNPA2B1形成RNA-protein复合物,进一步再与Cyp7a1和Abca1的m RNA形成RNA-protein-m RNA复合物、降低靶基因的表达量,从而逆向调节胆固醇的分解代谢。3.高浓度胆固醇首先激活细胞内固醇感受器LXRα从而上调活化C/EBPβ,进一步激活lnc-HC的转录表达。