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【目的】1.研究新的肿瘤相关抗原CML28在白血病细胞系及原代白血病细胞中表达;2.构建负载CML28肿瘤抗原的树突状细胞免疫应答疫苗,诱导特异性针对CML28抗原的细胞免疫应答;靶向沉默SOCS1基因在树突状细胞(DC)中的表达,增强CML28树突状细胞疫苗的免疫应答功能;3.靶向沉默CML28/hRrp46p在人慢性髓系白血病细胞系K562细胞中的表达,研究CML28基因表达与K562细胞凋亡与增殖的关系,探讨hRrp46p/exosome在K562细胞中的生物学功能。【方法】1.采用Trizol一步法抽提白血病细胞系以及原代白血病细胞总RNA,反转录成cDNA,利用Primer Premier 5.0设计针对CML28的PCR引物CML28-5P (5’-GGTAAA- CGCTAAGCCACG-3’) CML28-3P (5’-GAAGGAAGCAGAGCCATCT-3’),经序列同源性分析(BLAST),采用RT-PCR检测、研究CML28 mRNA在白血病细胞的表达,GAPDH作为内参照(GAPDH-5P 5’-GCTGGCGCTGAGTACGTCGT-3’,GAPDH-3P 5’-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3’)。2.设计针对CML28基因的特异性克隆引物CML28-5P1 (5’-CGGAATTCTGCGGACGCCCAGGAGGATG-3’) CML28-3P1 (5’-GCTCTAGA- GAGTGGGTGGAGGCAATG-3’),经BLAST分析,采用RT-PCR从K562细胞中扩增出CML28的cDNA全长;采用EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切PCR产物以及真核表达载体pcDNA3.1 HisA后,将酶切后的PCR产物定向克隆至pcDNA3.1 HisA获得重组载体pcDNA3.1 His-CML28,氨苄青霉素筛选酶切测序鉴定;采用RT-PCR方法CML28-5P2 (5’-CGCTCGAGCGGAGCTTACCATGG-3’) CML28-3P2 (5’-TCCCCGCGGGGAGA-GTGGGTGGAGGCAATC-3’),将His-CML28融合蛋白的编码序列定向克隆至IRES双表达载体pIRES2-EGFP获得重组载体pHis-CML28-IRES2-EGFP,卡那霉素筛选阳性克隆,酶切测序鉴定,DH5α扩增纯化重组质粒;从健康供体外周血中通过密度梯度离心获得外周血单个核细胞(PBMC),采用细胞因子诱导分化培养获得DC;采用电穿孔方法将pHis-CML28-IRES2-EGFP导入到DC中,以RT-PCR、Western Blotting以及荧光显微镜分别检测CML28 mRNA、His-CML28融合蛋白、GFP的表达,并评估转染效率;以CFSE标记未贴壁的同种PBMCs,与转染后的DC进行混和淋巴细胞培养(CFSE-MLR),采用流式细胞仪(FACS)检测分析同种反应淋巴细胞的增殖情况,分别选择不同的白血病细胞系、转染前后的DC、同种PBMCs以及原代白血病细胞作为靶细胞,以不同的效靶比(E :T)进行CTL细胞杀伤实验。利用载体介导的RNA干扰技术,采用siRNA Wizard设计靶向SOCS1基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列,经BLAST分析,构建靶向沉默SOCS1基因的siRNA表达载体psiRNA-SOCS1;采用电穿孔技术将CML28重组表达载体pHis-CML28-IRES2-EGFP和SOCS1干扰载体psiRNA-SOCS1共转染至DC中,采用RT-PCR研究检测siRNA对于SOCS1基因的干扰效率;对照比较干扰SOCS1表达前后,CFSE-MLR中DC对于同种反应淋巴细胞的刺激增殖能力以及效应细胞毒淋巴细胞对于靶细胞杀伤效应的影响,评价沉默SOCS1基因对于CML28树突状细胞疫苗的增敏效应。3.利用siRNA Wizard设计靶向针对CML28/hRrp46p的siRNA靶序列,经BLAST分析后,设计相应发卡结构及BbsⅠ粘性末端,siRNA1:Oligo 1: TCC C AA CAC GTC TTC CGT TTC TA T CAA GAG TAG AAA CGG AAG ACG TGT T TTOligo 2: CAA AAA AAC AGG TCT TCC GTT TCT A CT CTT GA T AGA AAC GGA AGA CGT GTT;siRNA2:Oligo1: TCCC AACA CGTC TTCC GTTT CTACC TTCAAGAGA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT TTOligo2: CAAAA AACA CGTC TTCC GTTT CTACC TCTCTTGAA GGTAG AAAC GGAA GA CC TGTT;siRNA 3:Oligo 1: TCCC AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TTCAAGAGA AGT AACGCCTCTGCAGCGATT TTOligo 2: CAAAA AATC GCTG CAGA GGCGTTACT TCTCTTGAA AGT AACGCC TCTGCAGCGATT;采用DNA连接酶将退火聚合后的siRNA连接到siRNA表达载体,转化大肠杆菌DH5α,通过蓝白筛选获得阳性克隆并测序鉴定,获得CML28特异性siRNA表达载体psiRNA-CML28;通过电穿孔导入到K562细胞中,采用RT-PCR (RT primer: 5’-AGCC CAAT CTTC G-3’;CML28 PCR Primer: 5’-GCTG CCAG GCGG AAGT GA-3’, 5’-CTGT TCGC AGGC AAAG TG-3’)筛选评价3个干扰载体对于CML28的基因沉默效率;采用CFSE标记K562细胞,FACS检测沉默CML28表达后K562细胞的增殖变化情况;采用Annexin-V/PI双染K562细胞,FACS检测CML28沉默后对K562细胞凋亡的影响。【结果】1.CML28 mRNA在白血病细胞系以及原代白血病细胞中有不同程度的表达,在急性髓系白血病细胞,加速期和急变期的慢性髓系白血病细胞中呈高水平表达,在急性淋巴细胞白血病细胞和慢性髓系白血病慢性期细胞中低水平表达。2.RT-PCR成功从K562细胞中扩增出CML28 cDNA全长,重组载体pcDNA3.1 His-CML28和pHis-CML28-IRES2-EGFP经酶切及DNA测序鉴定,含有正确的CML28编码序列;经细胞因子诱导分化培养,PBMCs能成功培养出具有典型形态特征以及免疫表型特征的DC;经电穿孔导入重组质粒pHis-CML28-IRES2-EGFP后,RT-PCR、Western Blotting分别证实CML28 mRNA以及His-CML28融合蛋白在DC中的表达,荧光倒置显微镜检测到GFP蛋白的表达;不同效靶比进行CFSE-MLR的FACS分析显示,同种反应淋巴细胞呈现出对应的增殖反应;CTL细胞杀伤实验结果显示,MLR获得的效应细胞能特异性杀伤MHC限制性相合的CML28阳性的靶细胞;RT-PCR检测显示,经电穿孔导入psiRNA-SOCS1重组质粒后,SOCS1 mRNA在DC细胞中表达水平呈现出与转染效率相关的不同程度下调;FACS检测CFSE-MLR结果显示,SOCS1表达下调后,同种反应细胞的增殖反应呈现不同程度的增强;CTL杀伤实验显示,SOCS1基因表达下调增加了效应细胞对于MHC相合CML28阳性靶细胞的杀伤活性。3.蓝白筛选的阳性克隆经测序鉴定,重组质粒psiRNA-CML28分别含有3个正确的siRNA靶序列;经优化电转转染条件,经电穿孔导入到K562细胞后,RT-PCR检测siRNA3导入后,CML28 mRNA水平被明显下调;Annexin-V/PI双染FACS检测K562细胞凋亡显示CML28表达被下调后K562细胞凋亡增加;CFSE标记的FACS检测增殖实验显示,CML28表达下调后,K562细胞增殖活性减低。【结论】1.CML28 mRNA在急性髓系白血病,加速期、急变期慢性髓系白血病细胞中均呈现高水平表达,在急性淋巴细胞白血病以及慢性期慢性髓系白血病细胞中低水平表达,是新的白血病相关抗原,从这个意义上,成功诱导CML28特异性的细胞免疫应答将为白血病的过继免疫治疗提供全新的靶点。2.利用供体PBMCs成功培养出具有典型形态特征以及免疫表型特征的DC;CML28树突状细胞核酸疫苗能诱导出针对CML28阳性靶细胞的特异性细胞免疫应答;siRNA介导的RNAi促进了DC免疫表型向成熟DC转变,增强了DC的刺激增殖能力,沉默SOCS1基因能有效增强CML28树突状细胞核酸疫苗的杀伤效应。3.siRNA下调CML28 mRNA在K562细胞中的表达,抑制了K562细胞的增殖,促进了其凋亡,提示CML28/hRrp46p不仅仅是一个肿瘤标志物,更与肿瘤的增殖和凋亡有着重要的联系;结合(1)期工作的研究,CML28/hRrp46p作为exosome的一个亚单位,其在白血病细胞中高表达,可能提示exosome在血液肿瘤中的功能亢进状态, exosome可能与肿瘤的增殖和凋亡有着密切的联系,可能存在CML28-hRrp46p-exosome-ZAP-HOX的通路串话,参与肿瘤的发生分化的生物学行为。