前言先天性肛门直肠畸形（Anorectal Malformations,ARMs）是小儿常见的消化道畸形,是世界卫生组织常规监测的先天畸形之一,占消化道畸形的1/4,发病率为1/5000～1/1500。尽管长期以来人们对肛门直肠畸形的手术方式进行着不断的改进,但中、高位ARMs的术后长期随访显示,仍有许多患者存在不同程度的排便、控便功能障碍。术后肛门直肠功能障碍是盆底神经肌肉发育不良所致,而肠道动力无疑是影响直肠肛管控便屏障最重要的因素之一,研究ARMs肠神经系统、肠道肌肉及神经肌肉联系的发育及其可能的调控机制已经很有必要。既往研究显示,在中、高位肛门直肠畸形患者中,其骶髓中枢及直肠末端的神经系统有不同程度的改变,但迄今为止,对其胚胎发育过程和详细的病理改变尚不清楚。胚胎学的研究进展已初步阐明肠神经系统胚胎学发生的机制。肠神经系统的胚胎发育来源于迷走神经嵴及骶神经嵴细胞,循肠管头尾方向发育增殖。ARMs在畸形发生后,是否伴随着神经嵴细胞迁移异常呢?抑或为迁移至肠壁后发育增殖异常呢?这些都是尚未解决的问题。先天性肛门直肠畸形的病因至今仍不明了。目前认为,肛门直肠畸形的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。流行病学和动物实验表明遗传因素在其发病过程中发挥重要作用。最近国外学者利用肛门直肠畸形动物实验研究发现,Shh、Hox、Fgf10、Wnt5a等多种基因在消化道末端发育中发挥重要作用。当上述基因异常均可导致动物出现肛门闭锁、肛门开口异位等畸形。在ARMs发生后,这些信号分子是否仍然继续在肠道发育中发挥重要作用并且在胚胎发育过程中的表达是否存在异常呢?在上述众多的信号分子中,高度保守的Wnt信号蛋白家族在胚胎发育中发挥着尤其重要的作用,已经引起了许多学者的注意。Wnt蛋白通过不同信号分子间的相互作用,触发了调节细胞生长、迁移、分化及发育等多方面的复杂信号级联反应,其中对Wnt5a的研究正在逐渐增多,但多是涉及人体各个系统发生的常见肿瘤,对于其在调控肠道发育胚胎发育的研究刚刚起步,尤其对于ARMs肠神经肌肉发育调控的机制目前尚不清楚。本文应用乙烯硫脲（ethylenethiourea,ETU）致畸的Wistar大鼠的ARMs动物模型,利用神经元、突触囊泡蛋白及氮能神经元的发育作为评价肠神经系统及肠道神经肌肉发育的标志物,应用相应的抗体即蛋白基因产物（protein gene product9.5,PGP9.5）、突触素（synaptophysin,SYP）及一氧化氮合成酶（nitric oxidesynthases,NOs）观察上述指标在胚胎发育过程中的表达及变化;同时分析Wnt5a及其受体Frizzled-1、TCF4蛋白和mRNA在正常及ARMs大鼠结肠的表达及变化情况,探讨正常及ARMs大鼠与排便控制密切相关的肠神经系统及肠道平滑肌的胚胎期发育的可能调控机制。另外,我们采用ARMs患儿的直肠末端组织对Wnt5a的表达进行了进一步验证,以期得到一些更为有益的研究启示。实验材料1、实验动物:体重250～300克的Wistar大白鼠,由中国医科大学附属盛京医院动物部提供。2、病例标本:ARMs患儿直肠末端标本20例:男14例,女6例,平均年龄8.5个月;其中高位畸形5例,中位畸形7例,低位畸形8例。7例死于非胃肠道疾病患儿的直肠末端标本为对照组:男5例,女2例,平均年龄7.3个月。3、实验试剂:①PGP9.5单克隆抗体（购自美国Abcam公司）;②SYP单克隆抗体、NOs、Wnt5a、Frizzled-1和TCF4多克隆抗体（购自美国Santa Cruz公司）;③免疫组化Ultra Sensitive^TMSp超敏试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司）;二步法山羊免疫组化检测试剂盒（购自北京中杉金桥公司）;④乙烯硫脲（Ethylenethiourea,ETU）（购自德国Sigma-Aldrich公司）;⑤逆转录试剂盒（购自大连宝生物工程有限公司）;⑥总蛋白抽提试剂盒（购自赛驰公司）。实验方法在成熟健康Wistar孕鼠妊娠第10天（E10）,按125mg/kg经胃管给予孕鼠灌入ETU（浓度为1%,以生理盐水做溶剂）,制作ARMs大鼠动物模型;对照组给予等量的生理盐水。分别在大鼠E15-E21时剖宫取胎,部分取完整胚胎或胚胎盆部,经4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定、脱水后制成蜡块,行矢状面、横断面的连续切片,分别进行如下实验:①PGP9.5、SYP及NOs免疫组化/荧光染色,以其作为胚胎期ENS发育的标志物,观察正常和ARMs大鼠ENS的胚胎发育过程;②进行Wnt5a、Frizzled-1、TCF4的免疫组化染色来大体比较上述因子在直肠壁内的表达情况。另一部分鼠胚通过显微镜下取材获得末端直肠标本,部分进行Wnt5a、Frizzled-1及TCF4 mRNA的RT-PCR实验,其余部分标本进行PGP9.5、SYP、NOs、Wnt5a、Frizzled-1及TCF4的western blot实验进行蛋白定量分析,G:BOXSYNGENE凝胶分析系统拍照,Kodark Digital Science 1.0 DNA分析软件进行半定量分析。所有数据均以（?）表示,差异比较采用SPSS 13.0统计软件进行各胎龄正常组与ARMs组的t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。人类正常及ARMs直肠末端标本进行Wnt5a的免疫组化及Western blot实验,对其表达进行定位和定量,并比较分析。结果1、正常与ARMs的直肠内ENS的胚胎发育过程及比较①PGP9.5标记的神经元的在直肠内的迁移发育情况:通过免疫组化结果显示,正常对照组,E16时:神经嵴细胞已经定植于整个后肠,直肠壁内可见散在阳性细胞,这时环肌层刚刚开始分化;从E16到E18,PGP9.5阳性细胞出现在环肌浆膜侧即肌间神经丛部位,成散在单个出现,E17-18时的直肠末端的纵肌纤维分布仍然稀疏,粘膜下PGP9.5阳性细胞少见;E20时,可以观察到黄褐色团块状的PGP9.5阳性反应的神经节细胞,呈团簇状,粘膜下也可见阳性细胞,E21天更为明显。而在同张切片中观察,同期的中肠肠壁的神经发育较后肠明显成熟。而在ARMs组:E16-17时神经嵴细胞在畸形组直肠中也可显示,与正常组定位无明显差异,但在直肠尿道瘘管周围未见阳性细胞;E18-19后近直肠盲端处仍可见阳性细胞,但分布与正常组相比,阳性细胞的分布较稀疏,瘘管周围仍未见阳性细胞分布;E20-21的直肠盲端阳性细胞分布与上位正常段结肠及正常组相比,密度减低,分布更为稀疏,并未见明显的神经细胞簇形成,发育滞后更明显。②NOs标记的氮能神经元发育情况:通过免疫荧光结果显示,与神经嵴细胞迁移发育过程伴随,氮能神经元的发育与之大致同步,但大约晚于PGP9.5阳性细胞出现在直肠区域一天以后,即出现在大鼠E17后的直肠壁内;E18时,直肠壁肌间出现清晰的阳性神经元,胞浆处有明显的荧光标记,出生前阳性神经元发育更趋于成熟;ARMs组与正常组相比,发育明显滞后;胎龄越大,差别越明显。③SYP的表达情况:正常对照组观察到:在E17时,直肠上端结肠壁内只能见散在零星分布荧光显示,但非常微弱;E18开始,结直肠壁内可见清晰强绿色荧光,主要分布在肠壁肌间位置,连续成条索状,上端结肠较直肠更为清晰,到E20以及出生前,荧光强度逐渐增强。在ARMs组:E16-17时结直肠大部分未见荧光显示,上位结肠与直肠处相比,偶可见极弱的零星分布的荧光;E18后上位结肠的发育更为成熟,近直肠盲端处仍可见绿色荧光,与上位正常段结肠及正常组相比,强度减弱,差别更明显,瘘管周围未见荧光显示。④PGP9.5、SYP和NOs的western blot结果显示上述因子的蛋白定量结果在E19、E21时两组均存在差别,具有统计学意义。2、Wnt5a等发育相关因子在正常和ARMs大鼠直肠壁胚胎发育期的表达对比①Wnt5a、Frizzled-1、TCF4免疫组化染色结果:正常组从E16～E21,肌间神经丛及肠道平滑肌及直肠粘膜层部位均观察到上述因子的表达,但是表达强度存在细微差别,随着肠管的发育成熟,其表达逐渐增强,不同部位间表达强度的差异也更明显,神经丛及肠道平滑肌的表达更强一些。ARMs组:E16时,未见阳性反应的细胞;E17-E21,阳性细胞逐渐显现,与正常胎龄的直肠同区域相比,表达减弱,在瘘管周围无阳性反应细胞。②Wnt5a、Frizzled-1和TCF4的western blot结果更清晰的显示了两组间三种蛋白定量的差别。③Wnt5a、Frizzled-1及TCF4 mRNA的RT-PCR实验结果显示,E17、19、21时,Wnt5a、Frizzled-1及TCF4在正常组表达水平较ARMs组高,具有统计学差异（p＜0.05）。与免疫组化及western blot结果基本相符。3、Wnt5a在正常和ARMs人类直肠壁表达的对比结果Wnt5a蛋白表达为棕黄色颗粒状,表达于人直肠壁肌间神经丛、粘膜层和粘膜下层,呈弥漫性全浆表达,肌层表达较弱。ARMs患儿的直肠壁并未观察到阳性表达细胞。Western蛋白印迹结果显示,ARMs高位组、中位组和低位组的蛋白表达水平均明显低于后天瘘组和正常对照组（P＜0.05）。不同畸形之间,高位组和中位组之间差异无统计学意义（P=0.11）,但二者明显低于低位组（P＜0.01）。后天瘘组与正常对照组比较没有明显差异（P=0.67）结论1、在正常及ARMs大鼠胚胎,在E16左右,神经嵴细胞迁移到直肠区域,但直肠末端神经发育很差,随着胚胎的进一步发育,直肠区域的肠神经系统发育逐渐完善,逐渐形成神经丛状结构,生后发育更加完善。ARMs大鼠胚胎的ENS在E16时,其形态与正常组无明显差异,从E18起,可观察到发育异常的ENS,随着胎龄的加大,与正常相比,发育差异更加显著。2、氮能神经元作为重要的神经元亚型,其发育过程是伴随神经嵴细胞的迁移而发育的,但稍迟一些,推测NO可能在肠神经系统发育过程中也起着重要作用,ARMs大鼠胚胎直肠末端区域的突触素的发育较正常组差,可能也是导致肠道动力改变的一个原因。3、E16～E21,Wnt5a及其受体Frizzled-1及Wnt经典通路的关键因子TCF4在ARMs组的肠壁粘膜、肌层及肠神经系统的表达较正常组减弱,可能与ARMs直肠神经系统及直肠末端壁平滑肌发育不良的调控相关。4、Wnt5a主要表达在人类直肠壁肌间神经丛部位,在肛门直肠畸形患者的直肠末端表达水平减低,推测Wnt5a在人类先天性肛门直肠畸形发生后的直肠神经系统进一步的发育中可能具有重要调节作用。