基于基因组分析香灰菌的多样性及其与银耳的伴生作用

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wsf3344
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银耳是药食两用价值非常高的一种食用真菌,又是食用菌中极为特殊的真菌,在整个银耳人工栽培过程中,都需要有香灰菌的参与。单独的银耳菌无法在以木质纤维素为主料的栽培基质上完成生活史,需要香灰菌为银耳的生长充当“开路先锋”。然而,并不是任何一个香灰菌都可以帮助银耳结实出耳,银耳与不同香灰菌之间的作用差异以及银耳与香灰菌相互作用的机制仍不是很清楚,这给银耳与香灰菌的遗传育种工作造成了一定障碍。本文对本实验室保藏的6株香灰菌菌株的菌落形态、拮抗观察及基质长势进行了比较试验,并进行了 ITS测序、出耳验证及遗传多态性分析,研究结果将这6个菌株分成了两类,其中一类和银耳菌配对可促使其在栽培基质中结实出耳,即菌株G03、Hp.sp0004、Hp.sp0006、Hp.sp0026,它们的ITS序列片段长度约为900 bp且相互之间的ITS序列相似性均在99%以上,并与NCBI上的Annulohypoxylon stygium(收录号为 FJ848854.1)和Hypoxylon sp(收录号为EU678667.1)的ITS序列相似性都达到99%;另外一类则无法使银耳菌在栽培基质中出耳,即菌株Hp.sp0029和Hp.sp0032,它们的ITS序列片段长度约为1000 bp,与 NCBI 上的 Fungalendophyte sp.(收录号为 EU818914.1)和Annulohypoxylon stygium(收录号为FJ008986.1)相似性均高达98%。另外,根据菌株分类结果,我们选取了 G03,Hp.sp0029或Hp.sp0032三个不同种类的菌株作为后续的研究材料。显微观察结果显示,菌株G03和Hp.sp0032的显微结构存在些许差异。并通过对古田主栽品种G03的离基出耳分析证实:银耳菌丝能够吸收G03菌丝体内的营养物质。因此,如果纯银耳菌丝接种到伴生菌菌丝体上,银耳菌丝就可以通过吸取其菌丝体内的养分供自身生长发育并结实出耳。再采用扫描电镜(SEM)技术分别对菌株G03和菌株Hp.sp0032与银耳菌的菌丝结构及连接结构进行观察,结果发现:银耳菌丝上带细丝的亚球型结构能够缠绕到G03菌丝上,而对菌株Hp.sp0032也存在粘附状的接触形态。然后,基于Illunina公司的二代测序技术Solexa测序平台,本实验重测序了菌株Hp.sp0029和Hp.sp0032,菌株Hp.sp0029基因组大小约为38 Mb,组装获得 944 条 Scaffold,GC 含量为 47.71%,其中 scaffold N50 为 73,467 bp。菌株Hp.sp0032基因组约为38 Mb,其中Scaffold有981条,GC含量超过47.04%,scaffold N50 为 65,876。通过 Augustus 基因预测软件,Hp.sp0029 获得预测基因9,359个,Hp.sp0032有9,030个,并对预测的基因进行了 GO、COG和KEGG注释。利用本地化salamand软件,对G03、Hp.sp0029及Hp.sp0032的基因组进行同源比对,共找到了 679个G03特有的基因,并推测这679个基因在菌株G03和银耳配对出耳过程中存在着极为关键的作用,进而对这679个基因进行了KEGG、GO、COG等功能注释。另外,对G03和Hp.sp0032以及银耳的基因组进行同源比对,结果除了与银耳共有的基因外,G03和Hp.sp0032分别剩下832个和862个特异基因,并分别对它们进行了 KEGG、GO、COG等功能注释,比较了它们的功能差异。通过选取PDA、葡萄糖(D-glucose)、可溶性淀粉(soluble starch)、木糖(D-xylose)、半纤维素(beechwood xylan)、纤维素(cellulose)、木质素(lignin)作为唯一的碳源以及不外加碳源(no carbon source)作为对照分别培养银耳和菌株 G03,Hp.sp0029 以及 Hp.sp0032,发现 G03,Hp.sp0029 以及 Hp.sp0032 能够降解利用半纤维素(beechwood xylan)、纤维素(cellulose)及可溶性淀粉(soluble starch),而银耳几乎无大分子多糖利用能力。银耳和两类香灰菌菌株CAZymes注释结果显示,银耳菌GH家族的种类不及香灰菌且缺乏一些植物病原菌或腐生菌用于降解植物细胞壁的GH家族。另外,银耳菌缺乏PL家族和AA9家族,也缺乏Cx酶编码基因(AA9、GH7),而GT48(Sugartr/MFS1)家族的数目要比两类香灰菌高出许多(347,208,223,222)。表明银耳自身固有的劣势导致其必须依赖一种降解能力强的真菌来弥补自身存在的缺陷。菌株G03,Hp.sp0029以及Hp.sp0032三者的CAZymes种类和数量极为相似,因而排除两类香灰菌基质降解上的差异。两类香灰菌菌株之间在 FAD binding domain、Cytochrome P450、NADbinding8和Major Facilitator Superfamily transporter/Sugar(and other)transporter及Biological adhesion过程中存在较大的差异,从而可能导致Hp.sp0029和Hp.sp0032无法将降解基质后的营养物质顺利地运输给银耳,以致银耳菌丝和Hp.sp0029或Hp.sp0032配对后无法顺利扭结出耳。因此,合适的伴生菌除了要有较强的基质降解能力外,可能还必须具备在两者之间建立顺畅的营养运输通道的特性。本研究中,我们证实了银耳与香灰菌之间的营养作用关系,发现了银耳吸取香灰菌养分的特殊结构,报道了两个无法帮助银耳结实出耳的香灰菌全基因组序列。并结合本实验室2012年完成的银耳T14和可帮助银耳结实出耳的菌株G03的全基因组序列,本文还完成了银耳和香灰菌的基因组功能比较及两类香灰菌之间的基因组差异和差异基因的功能注释,同时,本文还研究了两类香灰菌和银耳基因组内的CAZymes家族含量分布,分析比较了 13种真菌基因组内的CAZymes家族分布情况,以及两类香灰菌的CAZymes差异。为深入理解银耳与香灰菌之间的相互作用机制奠定理论基础。
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