论文部分内容阅读
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是困扰我国人民健康的重要传染性病原体,据统计全球有3.5亿左右的HBV感染者或者病毒携带者,中国有1.2亿左右,这些HBV感染者有相当一部份发展成为慢性乙型肝炎,有些还可能进一步演变为肝硬化、肝细胞癌等。国外有报道使用重组的肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor,TNF-α)可以非杀细胞的方式抑制HBV的复制,但是具体机制仍不清楚。目前一般认为,肿瘤坏死因子α介导的抗病毒效应实质是病毒和宿主细胞两方面因素共同作用的结果,肿瘤坏死因子可以通过和受体的结合,引起一系列的信号的传导过程,从而上调一些抗病毒蛋白的表达。
本室刘晓颖博士应用含有14112个靶基因的人cDNA微点阵,检测了经TNF-α处理6小时前后HeoG2细胞基因转录水平的变化情况。结果发现其中8个基因发生上调,23个基因发生下调。应用Real Time-PCR验证,证实cIAP2,B4-2,diubiquitin和MAD3等基因的转录水平可受TNF-α调控,其中cIAP2蛋白能被显著的上调。cIAP2蛋白是抑制凋亡蛋白(IAP)家族的一员,其C端为Ring结构,具有泛素连接酶3的活性;其N端为三个BIR模序,它们通过不同方式可以阻止多种内、外源性信号所诱发的细胞凋亡,刘晓颖博士使用cIAP2蛋白表达质粒与HBV复制型质粒瞬时共转染肝细胞,并检测其对HBV基因复制和表达的影响,结果发现TNF-α在抑制HBV复制的同时,可以上调细胞内源性cIAP2蛋白的表达;cIAP2蛋白单独表达即可抑制HBV蛋白的合成、基因的转录和复制。同时应用siRNA干扰cIAP2蛋白的内源性表达后再用TNF-α进行处理,发现TNF-α对HBV RNA的抑制作用被减弱,提示cIAP2蛋白在TNF-α抑制HBV复制信号通路中发挥重要作用,但尚不明确其作用机制。
本研究首先重复刘晓颖博士siRNA的结果,ELISA.检测证实针对cIAP2蛋白的siRNA可以减弱TNF-α抑制HBV复制的作用。进而构建或获得cIAP2蛋白的多种突变体,包括全长cIAP2(pRK5-Flag-clAP2),cIAP2蛋白C端Ping结构部分缺失质粒(pRK5-Flag-cIAP2△),单独表达cIAP2蛋白的N端质粒(pRK5-Flag-cIAP2 N)以及单独表达其C端的质粒(pRK5-Flag-cIAP2 C)。将以上突变体和HBV复制型质粒pHBV3.8(Adr)共同瞬时转染Huh-7细胞,结果发现cIAP2和cIAP2 C能够降低细胞上清中HBsAg,HBeAg的水平,同时能抑制细胞内HBV的总RNA以及复制中间体HBV DNA的的水平,而cIAP2△和cIAP2N却不表现出上述的变化,结果提示cIAP2蛋白抑制HBV的复制依赖于其C端的Ring结构的完整性。鉴于Northern Blot结果显示cIAP2蛋白能够抑制细胞内HBV的总RNA水平,本研究检测了cIAP2以及pRK5空载对于HBV四个启动子报导质粒SP1,SP2,EnI/Xp,EnII/Cp活性的影响。双荧光报道系统检测结果发现,与空载相比,全长的cIAP2蛋白并不能显著的影响HBV的启动子的活性,表明cIAP2蛋白并不是通过影响HBV的启动子的活性来发挥抑制:HBV复制的作用。有文献报道转录因子NF-κB可以调节cIAP2蛋白的表达,而cIAP2蛋白又可通过正反馈的方式再次激活NF-κB。为了检测cIAP2蛋白抑制HBV的复制是否通过激活NF-κB信号通路,将HBV复制型质粒Adr,cIAP2单独以及.Adr和cIAP2一起与NF-κB报道质粒共同转染Huh-7细胞,同时加入重组的人TNF-α作为阳性对照。结果显示,与对照组相比,单独加入TNF-α或者在有HBV的情况下加入TNF-α,都可以显著的上调NF-κB报道质粒的活性,而cIAP2不能显著地上调NF-κB报道质粒的活性。以上结果表明cIAP2蛋白抑制HBV的复制并不是通过激活NF-κB信号通路来实现。
文献报道cIAP2具有E3连接酶的活性,可以促进一些底物蛋白,譬如casp2Lse3等的降解。德国的一个研究小组报道,另一种E3连接酶Nedd4可以促进HBV Core蛋白的泛素化。为了阐明cIAP2是否通过发挥E3连接酶的作用从而促进HBV关键蛋白的降解,进一步构建了HBV蛋白的表达质粒,分别为pEGFP-HBV-Core,pEGFP-HBV-X,pcDNA3.1-3×Flag-HBV polymerase。将上述质粒分别与全长的cIAP2质粒和Ring结构部分缺失质粒cIAP2△一起瞬时共转Huh-7细胞,48小时后检测上述蛋白的表达。Western Blot结果发现,与空载和突变体相比,全长的cIAP2蛋白并不能影响HBV-Core和HBV-X的表达,但是能够抑制HBV多聚酶蛋白的表达。进一步的剂量依赖试验证明cIAP2能够以剂量依赖的方式抑制HBV多聚酶蛋白的表达,而cIAP2△则没有表现上述特性。在上述实验中加入蛋白酶体抑制剂MG132,结果发现MG132能够阻止cIAP2蛋白抑制HBV多聚酶蛋白表达的作用,提示cIAP2蛋白能够促进蛋白酶体对于HBV多聚酶蛋白的降解。
综上所述,本研究部分揭示了TNF-α诱导的cIAP2蛋白抑制HBV复制的机制;证明cIAP2抑制HBV的作用依赖于其C端的Ring结构,并且发现cIAP2不能抑制HBV启动子的活性,也不能通过激活NF-kb信号通路来发挥其抑制HBV复制的作用;cIAP2能够促进HBV多聚酶蛋白的降解,并且这种促进作用可以被蛋白酶体抑制剂MG132所阻断。本研究丰富了TNF-α抑制HBV作用机制的认识,并为研制新型抗HBV药物提供了理论依据和实验基础。