【摘 要】
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目的:正常生理条件下,机体内的氧化性物质和还原性物质共同维持机体氧化还原平衡,一旦氧化还原稳态失衡则会影响基因转录、信号转导、细胞损伤等,诱发诸多疾病发生发展。超氧自由基(O2·-)和谷胱甘肽（GSH）是氧化性物质和还原性物质的代表,其精准检测对氧化还原态的准确评价意义重大。在O2·-与GSH的诸多检测方法中,电子顺磁共振（EPR）波谱法因合适的磁场穿透深度、无背景干扰、无创性、可连续重复检测、谱
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目的:正常生理条件下,机体内的氧化性物质和还原性物质共同维持机体氧化还原平衡,一旦氧化还原稳态失衡则会影响基因转录、信号转导、细胞损伤等,诱发诸多疾病发生发展。超氧自由基(O2·-)和谷胱甘肽（GSH）是氧化性物质和还原性物质的代表,其精准检测对氧化还原态的准确评价意义重大。在O2·-与GSH的诸多检测方法中,电子顺磁共振（EPR）波谱法因合适的磁场穿透深度、无背景干扰、无创性、可连续重复检测、谱图呈特异性且可定量等特质备受青睐。近年来,四硫取代三苯甲基（TAM）自由基在EPR研究领域饱受关注,因其具有狭窄的EPR单线信号、高度的生物稳定性和良好的生物相容性,是一类性能优越的稳定自由基,已被应用于细胞内外氧气、O2·-、巯基、p H、总体氧化还原态检测与成像以及磁共振成像增强试剂等。但O2·-探针尚存在生物稳定差、特异性不强的缺点,而巯基探针仍存在检测灵敏性低、无法区分性定量检测的弊端。针对上述问题,本论文拟基于TAM自由基,设计合成新型适于在体应用的O2·-探针和巯基探针,开发TAM自由基功能衍生化方法,为提高TAM自由基在EPR领域的深度应用提供新策略、新方法和新思考。方法:（1）在芬兰TAM自由基CT-03的结构基础上,将三个羧基用硫原子取代获得新型全硫取代TAM自由基PST;分别用三叉和九叉树枝状分子对PST进行修饰,得到PST衍生物PST-TA与PST-NA;对PST及其衍生物作为O2·-探针的反应性、特异性及生物稳定性进行比较研究;将性能最为优良的新型O2·-探针PST-NA与经典自旋捕获试剂DMPO的检测灵敏性进行对比研究,并最终将PST-NA应用于小鼠巨噬细胞,以PMA和DPI作为对照,测试不同刺激状态下探针检测细胞产生O2·-的能力。（2）合成CT-03的三酯基（ET-03）和三酰胺基（AT-03）取代衍生物;对无氧条件下两种衍生物与巯基化合物混合系统中三苯甲基碳负离子的生成进行检测;在有氧条件下对两种衍生物与巯基化合物混合体系中O2·-的产生、氧气的消耗、巯基的消耗等多个反应因子进行检测与比较。（3）将CT-03分子结构中的其中一个羧基以硫甲磺酰基取代合成得到新型巯基探针MTST;对MTST与各种巯基化合物的反应性进行研究;采用计算机模拟对形成的巯基加合物EPR谱图特性进行分析研究;辅助HPLC方法对MTST区分性定量检测不同巯基化合物能力进行了评价,并最终将MTST应用于肝癌细胞测试探针区分性定量检测细胞不同刺激条件下外排GSH和Cys的性能。结果:（1）PST对O2·-具有高度反应性(二级反应速率常数为2.31×10~4M-1·s-1),但对GSH有一定响应;经三叉和九叉树枝状分子修饰后的PST衍生物PST-TA和PST-NA虽对O2·-的反应性略有降低(二级反应速率常数分别为1.24×10~4M-1·s-1和1.18×10~4M-1·s-1),但其生物稳定性大大提高;在Asc存在条件下,PST-NA对O2·-的检测灵敏性较DMPO提高三个数量级。将PST-NA用于小鼠巨噬细胞体系检测O2·-水平时,PST-NA能够有效响应各种刺激条件下的O2·-水平变化。（2）无氧条件下,CT-03酯基和酰胺基取代衍生物ET-03和AT-03可被巯基化合物（如GSH）还原产生三苯甲基碳负离子;有氧条件下,碳负离子可以传递电子给氧气生成O2·-,伴随着氧气与巯基消耗的同时,碳负离子被氧化回到起始TAM自由基状态。（3）MTST可以与不同小分子巯基快速反应,且形成的巯基加合物均具有特征指纹性EPR谱图;利用巯基加合物各自特征的EPR谱图参数,辅助计算机模拟,MTST可以在体外实现对于不同巯基的区分性定量检测;MTST应用于肝癌细胞中可以区分性定量检测细胞外排GSH与Cys的动态变化。结论:（1）新型全硫取代TAM自由基树枝状衍生物PST-NA具有良好的O2·-反应性、特异性及生物稳定性和生物相容性,极具在体O2·-精准检测与成像潜质。（2）CT-03酯基和酰胺基取代衍生物ET-03和AT-03可被巯基化合物还原产生三苯甲基碳负离子,碳负离子可以被空气中的O2迅速氧化回到起始TAM自由基,与此同时氧气被还原成为O2·-。（3）硫甲磺酰基单取代TAM自由基MTST对不同巯基分子具有良好的区分性响应,具有在体区分性定量检测不同巯基化合物的潜质。
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