【摘 要】
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首先,我们进行了抗VACVFab噬菌体抗体库的构建。我们先采集具有高滴度VACV抗体的免疫鼠脾,分离淋巴细胞,然后进行总RNA的提取以及cDNA的合成,接着用一系列特异性的PCR引物通
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首先,我们进行了抗VACVFab噬菌体抗体库的构建。我们先采集具有高滴度VACV抗体的免疫鼠脾,分离淋巴细胞,然后进行总RNA的提取以及cDNA的合成,接着用一系列特异性的PCR引物通过PCR扩增特异性轻链基因和重链Fd段基因,在对PCR产物鉴定和纯化后,用轻链混合物与噬菌粒pComb3构建轻链库,随后随机挑选克隆进行轻链插入率鉴定,在确保轻链库的质量后,将重链混合物克隆入轻链库中构建Fab噬菌体抗体库,同样随机挑选克隆进行重链插入率鉴定。最后使用辅助噬菌体对Fab噬菌体抗体库进行包装,检测库容量,结果表明我们所构建的Fab噬菌体抗体库的容量为2×107,轻链插入率和重链插入率分别为100%和90%,足以满足我们筛库的需要。
在成功构建Fab噬菌体抗体库的基础上,我们用纯化的VACV病毒对Fab噬菌体抗体库进行富集,目的是扩大筛选范围,有效地筛选出特异性抗VACVFab抗体。随机挑选50个3次富集筛选后的单菌落对其进行了诱导表达,并通过ELISA进行筛选,共获得10株阳性克隆,这10株克隆均有较高的Fab表达,其中3株与纯化VACV有特异性的结合,其生物学功能还需进一步研究鉴定。
本文进行了鼠源抗VACVFab噬菌体抗体库的构建及抗体库的初步筛选,为下一步Fab抗体生物学功能鉴定及全抗体的制备奠定了基础。
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