【摘 要】
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本研究应用RNAi技术敲降肿瘤细胞中异常高表达的DNA甲基转移酶1（DNMT1）,并观察肿瘤细胞恶性表型的变化,以期探讨DNMT1与抑癌基因异常甲基化等肿瘤恶性表型之间的关系,以及DNMT1
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本研究应用RNAi技术敲降肿瘤细胞中异常高表达的DNA甲基转移酶1（DNMT1）,并观察肿瘤细胞恶性表型的变化,以期探讨DNMT1与抑癌基因异常甲基化等肿瘤恶性表型之间的关系,以及DNMT1在肿瘤发生发展中的作用,进而讨论以DNMT1作为RNAi治疗肿瘤靶标的应用前景。 首先采用MSP、COBRA等DNA甲基化检测技术,RT-PCR、Real-time PCR和Western blot等基因表达检测技术筛选获得DNMT1高表达而抑癌基因RASSF1A异常甲基化失活的细胞系NCI-H157（非小细胞肺腺癌）。以该细胞系作为RNAi敲降DNMT1的体外细胞模型,应用RT-PCR、荧光定量PCR等技术,筛选获得两个有效的RNAi靶位,分别为SD1和SD5。SD1敲降DNMT1的表达后,RAFF1A表达得以恢复,同时,NCI-H157的增殖受到抑制。流式分析结果显示,SD1能够诱导NCI—H157G1期阻滞。为获得稳定敲降DNMT1的细胞系,本研究着手建立了四环素诱导型shRNA表达系统,通过共转染报告基因Luciferases表达载体筛选获得了高表达四环素抑制子TR的pcDNA6TR稳定转染株,并构建了分别表达SD1和SD5的重组表达载体pTER+-shRNA（SD1）和pTER+-shRNA（SD5）。 上述结果表明,肿瘤细胞中DNMT1的高表达是导致抑癌基因异常甲基化的重要原因,敲降DNMT1表达,能够在一定程度上逆转肿瘤的恶性表型。探讨和阐明DNMT1在肿瘤发生发展中的作用不仅是重要的基础研究课题,对于临床治疗也具有重要意义。 本研究检测了NCI-H157细胞中抑癌基因RASSF1A、p16基因调控区CpG岛的甲基化情况,以及DNA甲基转移酶1（DNMT1）的表达,结果显示p16启动子区CpG
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