论文部分内容阅读
泛素化及去泛素化是机体生命进程中必不可少的翻译后修饰过程,蛋白经泛素化修饰后被降解,去泛素化酶则能逆转泛素化过程使蛋白免受降解。在去泛素化蛋白的五类家族中,泛素特异性激酶2引起了人们的关注。USP2有三个异构体,USP2a、USP2b以及USP2c,他们的C端结构相同而N端结构不同,它们都能使底物去泛素化,而N端结构的不同造就了它们的底物特异性。其中USP2a作为一种抑癌基因在多种癌症细胞中高表达,其保护癌细胞不凋亡。USP2a具有多种底物,USP2a的高表达不仅能造成FASN的累积使FASN水平紊乱,从而抑制细胞色素C的释放及Caspase的失活;USP2a高表达还造成MDM2水平的紊乱,使得抑癌基因p53泛素化增多,最终导致p53诱导的肿瘤细胞的凋亡减少。Cyclin D1也是USP2a的重要底物之一,Cyclin D1是细胞由G1期过渡到S期的重要调控因子,癌细胞中可明显观察到Cyclin D1表达水平升高。USP2a与癌症之间的关系提示:USP2a可能是一个重要的癌症治疗药物靶点,因此本课题组决定以USP2a为研究对象,建立USP2a抑制剂体外筛选体系,并对一系列化合物进行活性筛选。在USP2a抑制剂体外筛选体系的建立过程中,首先构建了Human-USP2a/USP2催化区质粒及Human-UBA52质粒并在大肠杆菌(BL21)中进行表达,后通过镍柱纯化法得到USP2催化区蛋白及底物GST-UBA52,此外,通过SDS-PAGE检测、Western Blot检测、考马斯亮蓝染色、灰度扫描及定量等方法确定了底物和酶的最佳用量及最佳反应时间等。最终,建立了USP2a抑制剂体外筛选体系。利用建立的筛选平台,发现天然药物紫菀酮(Shionone,SH)在体外对USP2a具有抑制作用,并通过Ub-CHOP-Reporter Kit测试验证了这一结果;同时体内实验结果显示:SH能够引起NB4细胞(USP2高表达)中USP2底物蛋白Cyclin D1的表达水平下调;流式细胞术检测结果显示:SH处理NB4细胞48h时S,G2/M期细胞减少,细胞死亡增多;分子对接结果显示:SH的氧原子及其骨架中心和USP2的K503、W439、R363及D440对于两者之间的结合起到重要作用。总之,研究为发展新的USP2抑制剂提供了先导化合物,也为紫菀酮在肿瘤中的应用提供了实验理论依据。