植物SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor protein attachment protein receptor)蛋白是参与细胞膜融合过程的一类蛋白,在植物生长发育和逆境胁迫的应答和防御反应中发挥重要作用。近十年来,水稻(Oryza sativa)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)基因组的测序、重测序和深度测序及相关组学等研究取得了很多进展,逐步使得水稻-稻瘟病菌成为研究植物-病原真菌互作分子机理的模式生物组合。本实验室前期利用基因芯片技术,从高抗稻瘟病粳稻地方品种黑壳子粳幼苗组织中鉴定了一个受稻瘟病菌显著诱导的SNARE蛋白基因OsSYP121 (syntaxin of plant 121)。本论文以该基因为探针,从水稻中分离克隆了SYP1亚家族的6个基因,分析研究了这些基因的生物信息学特征、组织表达和稻瘟病菌诱导表达特性及其编码产物的亚细胞定位等,并利用农杆菌介导的转基因技术对OsSYP121基因在水稻抗稻瘟病中的功能进行验证。主要结果如下：1、利用RT-PCR方法从抗病品种黑壳子粳幼苗中克隆了SYPl亚家族的6个基因：OsSYPlll, OsSYP121, OsSYP124, OsSYP125, OsSYP131和OsSYP132。生物信息学分析结果表明,OsSYPls基因所编码的蛋白在氨基端依次排列有Ha、Hb和Hc三个α螺旋,羧基端是一个跨膜结构域,靠近跨膜结构域的是一个Qa-SNARE结构域。构建了拟南芥和水稻中的所有15个SYP1成员的系统进化树,分析SYP1亚家族的各成员间的进化关系,发现在水稻和拟南芥中,该亚家族均可划分为SYP11, SYP12, SYP13三个亚组。内含子-外显子结构分析发现SYP11s和SYP12s亚组的各成员不含或者仅含一个内含子,SYP13s亚组各成员含有8-12个内含子。说明SYP1亚家族是一个古老且保守的家族,可能起源于单,双子叶植物分化之前,内含子-外显子结构出现异化,是在进化过程中基因发生功能分歧的重要体现。2、利用半定量RT-PCR技术分析水稻OsSYPlll, OsSYP121, OsSYP124和OsSYP132等四个基因的组织表达和稻瘟病菌诱导表达特征。发现OsSYP121和OsSYP132在水稻多种组织中均有表达；OsSYP111和OsSYP124表现为组织特异性表达,其中,OsSYP111仅在含分裂细胞的组织中表达,如根和幼穗,OsSYP124在叶,叶鞘和幼穗组织中表达,且幼穗中表达量较高。用日本的稻瘟病菌小种“北1”接种抗病品种黑壳子粳和感病品种苏御糯,测定了四个OsSYP1s_基因受稻瘟病菌诱导表达特性,发现OsSYP121在两个水稻品种接茵后均有较强的诱导表达,苏御糯出OsSYP121的表达量在接种后8 h达到最高水平,随后表达量逐渐下降；黑壳子粳中OsSYP121表达量在接种24 h内都是持续、显著增强。其他三个基因变化不显著。推测OsSYP121可能在水稻-稻瘟病菌的互作过程中发挥作用。利用水稻原生质体瞬时表达体系研究这四个基因的亚细胞定位特征,结果表明OsSYP121和OsSYP132定位于水稻细胞质膜,而OsSYP111和OsSYP124定位于水稻细胞质膜和高尔基体。3、构建OsSYP121的过量表达和RNAi干涉抑制表达载体,采用农杆菌介导的转基因技术,分别转化感病品种苏御糯和抗病品种黑壳子粳,获得3个过量表达的转基因株系(OE-5, OE-8, OE-11)和2个干涉抑制表达的株系(R1,R57)。T2代转基因植株农艺性状调查结果表明,与野生型苏御糯相比,OsSYP121过表达植株的株高显著下降,植株的结实率和百粒重也略有降低：与野生型黑壳子粳相比,OsSYP121干涉抑制表达的植株的株高没有差异。4、用“北1”接种OsSYP121转基因T3植株,鉴定其稻瘟病抗性,结果表明接种7天后,野生型苏御糯的叶片病症严重,出现典型的梭型病斑,部分病斑连成片覆盖整个叶片,而3个过表达株系的叶片的病症较轻,单株叶片平均病斑数较苏御糯显著降低,病斑长度变化不大：抗病品种黑壳子粳的2个干涉抑制表达株系均表现出感病病斑,病斑扩展大,中央出现灰白色的崩渍部,而野生型的黑壳子粳在接种7天后,没有任何病斑。利用Uvitex染色方法观察了稻瘟病菌孢子在过表达株系和苏御糯叶片上萌发及菌丝侵染进程,发现在过表达植株的叶片上,稻瘟病菌孢子萌发迟缓,接种24 h后,62.65-70.01%的萌发孢子停留在附着胞阶段,无法继续侵入,显著高于野生型(25.61%)。结果表明OsSYP121过量的表达可能抑制稻瘟病菌的侵染,降低了侵入率,提高了感病品种苏御糯的稻瘟病抗性。5、选取中国稻瘟病鉴别品种,日本稻瘟病鉴别品种等32份水稻材料,扩增各品种SYP121基因的编码区和1.5 kb启动子区域进行测序。发现这些品种的OsSYP121的编码区序列完全一致,启动子序列存在较大差异。启动子区包含了38个SNP,2处碱基缺失和2处碱基插入。通过多重比对分析序列差异,可以分为5类不同的OsSYP121启动子序列。结合顺式作用元件分析,显示有5处序列差异引起顺式作用元件变化,分别是3个光响应元件和2个非生物胁迫响应元件(热激胁迫元件HSE和受干旱胁迫诱导的MYB结合位点MBS)。这些元件的变化可能对OsSYP121的表达调控产生影响。尽管如此,OsSYP121蛋白结构在水稻悠久的演化进程中是高度保守。6、利用DUALmembrane酵母双杂交系统筛选黑壳子粳cDNA文库,获得3个OsSYP121的互作蛋白：121P1、121P2和121P3。通过BLAST同源比对及蛋白二级结构域分析,发现121P1是一个热激蛋白(Heat Shock Protein 90); 121P2是光系统11的10kDa多肽,叶绿体前体；121P3是丙酮酸脱氢酶激酶异型1。7、根据已报道的AtSYP121-AtSNAP33-AtVAMP7 SNARE核心复合体成员,从水稻中克隆了它们的同源基因OsSNAP32和6个OsVAMP7亚家族的成员(OsVAMP727, OsVAMP724, OsVAMP722,OsVAMP721, OsVAMP714知OsVAMP711)利用酵母双杂交体系(BD/AD)和DUALmembrane体系验证了OsSYP121与OsSNAP32、OsSYP121与OsVAMP724、OsSYP121与OsVAMP714在酵母体内发生互作,为进一步分析OsSYP121在水稻稻瘟病抗病过程中的机理研究奠定了基础。以上结果说明OsSYP1亚家族是一个古老且高度保守的家族,每个成员在水稻的生长发育和逆境胁迫的应答和防御反应中都具有特异的功能,其中,OsSYP121通过囊泡运输参与水稻对稻瘟病菌的抗病途径。