论文部分内容阅读
人和小鼠的诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)体外可被诱导分化为原始生殖细胞(primordial germ cell, PGCs)、精子细胞(spermatid)及其前体细胞,这些研究不仅可避免胚胎干细胞研究领域免疫排斥和伦理道德等问题,还为揭示雄性生殖细胞的发育机制提供了较好的研究平台,为将来治疗雄性不育提供技术支撑。小鼠支持细胞(sertoli cells)是睾丸的重要组成成分,具有免疫豁免和为生精过程提供适宜微环境的作用。支持细胞分离纯化后容易得到高纯度的同质性细胞群,排除了异质性细胞群的干扰,因此,支持细胞是诱导iPS细胞比较理想的原材料,支持细胞源的iPS细胞体外分化为雄性生殖细胞的研究也具有重要的意义。本实验主要是研究体外分化与体内移植小鼠支持细胞源的诱导多能性干细胞,分为以下几个方面：小鼠支持细胞体外被诱导为iPS细胞；添加维甲酸(Retinoic acid,RA)体外诱导iPS细胞向雄性生殖细胞分化；白消安阴囊注射法制作精子再生模型；通过小鼠输出管将未分化及分化后的细胞移植到白消安处理过的小鼠睾丸内。研究结果如下：1、小鼠支持细胞在体外可被诱导为iPS细胞：通过逆转录病毒将四种重编程因子导入小鼠支持细胞,同时以GFP空载体检测病毒感染情况。感染的支持细胞3d左右表达GFP蛋白,同时细胞开始缩小聚集,失去原有支持细胞形态,逐步形成突起样克隆,16d左右感染的支持细胞不表达GFP蛋白,形成具有典型干细胞特征的iPS细胞。2、RA诱导iPS细胞体外向雄性生殖细胞分化：iPS细胞体外悬滴培养形成拟胚体,拟胚体自分化可形成三胚层细胞,最显著的是可看到心肌细胞的跳动；添加RA进行诱导分化后,通过RT-PCR可检测到Oct4、Stra8、Dazl、Mvh、VASA、GFRα1等雄性生殖细胞相关基因的表达。3、小鼠阴囊注射白消安制作精子再生模型：本实验采用阴囊注射法获得精子再生模型。4、小鼠睾丸输出管移植未分化及分化的细胞：将未分化与分化的细胞通过小鼠睾丸输出管移植到白消安处理过的受体小鼠内,单独饲养,随机取公鼠分别与成年健康空怀母鼠同笼,见阴道栓后,分笼继续饲养,对F1代个体进行外貌形态、活体荧光、睾丸支持细胞荧光、睾丸支持细胞和精子DNA鉴定,后代小鼠中无阳性小鼠。