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慢性乙型重型肝炎的临床病死率高,迄今尚无十分理想的治疗方法。研究证实肠源性内毒素血症在重型肝炎的发生发展中起重要作用。高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为晚期炎症介质,参与了内毒素血症的发生与发展过程；调节性T (Treg)细胞可维持机体对HBV感染的免疫耐受,而通过控制炎症反应减少重型肝炎的发生。在败血症、烧伤、急性胰腺炎、脑卒中及出血性休克等多种严重疾病的动物模型实验中已证实：丙酮酸乙酯(EP)能改善肝、肾及肠道粘膜的损伤,并能抑制多种促炎症介质的表达。基于上述研究背景,本研究首先通过体外实验探讨了HMGB1及Treg细胞在慢性乙型重型肝炎发病机制中的作用,以及HMGB1对Treg细胞免疫活性的影响,接着通过体内实验探讨了EP作为HMGB1的拮抗剂,对慢加急性肝衰竭(ACLF)大鼠模型的保护作用,并观察了多种炎症因子的表达水平变化。(1)体外实验：选取15例慢性乙型重型肝炎患者,20例普通慢性乙型肝炎(CHB)患者,10例健康人作为研究对象。应用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMCs)。分别应用ELISA法、实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法检测各组患者的血清、PBMCs及肝组织中HMGB1的表达水平。应用流式细胞术检测各组患者PBMCs中CD4+CD25+CD127low Treg细胞占CD4+细胞的比率。然后,从CHB患者PBMCs中分离CD4+CD25+CD127low Treg细胞,并采用不同剂量或不同处理时间给予HMGB1进行刺激。通过单向混合淋巴细胞反应(MLR),观察被HMGB1处理后的Treg细胞抑制淋巴细胞增殖的能力变化,同时应用实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法检测被HMGB1处理后的Treg细胞中叉头状转录因子P3 (Foxp3)的表达水平变化。结果发现：慢性乙型重型肝炎患者血清HMGB1水平明显高于CHB患者(82.6±20.1μg/L vs. 34.2±13.7μg/L, t=8.48, P<0.01)；CHB患者血清HMGB1水平与健康人之间比较无显著性差异(34.2±13.7μg/L vs.27.8±6.5μg/L, t=1.73, P>0.05)。RT-PCR及Western blot检测结果进一步证实：慢性乙型重型肝炎患者PBMCs中HMGB1 mRNA水平(5.21±0.42 vs.1.78±0.18,t=29.43,P<0.01)及肝组织中HMGB1蛋白的表达水平(4.86±1.07vs.1.43±0.35,t=13.46,P<0.01)均明显高于CHB患者。CHB患者PBMCs中Treg细胞占CD4+细胞的比率明显高于健康对照(9.52%±3.89%vs.3.21%±1.21%,t=4.97,P<0.01)；而慢性乙型重型肝炎患者Treg细胞占CD4+细胞的比率明显低于CHB患者(4.55%±1.34%vs.9.52%±3.89%,t=4.73,P<0.01)。经HMGB1采用不同剂量或不同处理时间体外刺激的Treg细胞抑制淋巴细胞增殖的能力明显减弱,Treg细胞中Foxp3的表达水平亦明显降低,并且均呈现剂量、时间依赖性。实验结果证实HMGB1表达的增高及Treg细胞比率的降低在慢性乙型重型肝炎的发病机制中起重要作用,而且HMGB1能抑制Treg细胞的免疫活性。这提示有效抑制HMGB1的表达可通过抑制内毒素血症的发生及增强Treg细胞的免疫活性,在慢性乙型重型肝炎的治疗中发挥作用。(2)体内实验：应用人血白蛋白、D-氨基半乳糖及脂多糖构建慢加急性肝衰竭(ACLF)大鼠模型。实验动物随机分成3组：对照组、模型组及EP治疗组。EP治疗组大鼠分别在诱导ACLF模型后3h、6h、12h及24 h时间点,给予EP (40 mg/kg)治疗。在诱导ACLF模型后48h时间点处死大鼠,并留取标本用于以下指标检测。ELISA法检测血清HMGB1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、白介素(IL)-10及IL-18水平；生化法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。HE染色观察肝组织病理学变化；透射电子显微镜观察肝细胞超微结构变化；实时荧光定量RT-PCR法及Western-blot法分别检测肝组织中HMGB1 mRNA及蛋白水平的变化。绘制生存曲线,观察EP治疗对ACLF大鼠生存时间的影响。结果显示：与对照组比较,模型组大鼠血清HMGB1、ALT. TNF-α、IFN-γ、IL-10及IL-18均显著升高；并且模型组大鼠肝组织在诱导ACLF后48 h时间点呈现严重的病理学损伤,表现为大量炎性细胞浸润、肝索紊乱、大量肝细胞肿胀、核变大、染色变浅、核仁溶解。然而,EP治疗组大鼠不论在诱导ACLF后3h、6h、12h或24h时间点给予EP治疗,均能显著改善肝脏组织学,表现为炎性细胞浸润明显减少、肝索排列较整齐、肝细胞肿胀减轻、核仁溶解较少；并且EP治疗能降低ACLF大鼠血清HMGB1、ALT、TNF-α、IFN-γ、IL-10及IL-18水平,以及肝组织中HMGB1的表达。ACLF大鼠的平均生存时间为60 h；而在诱导ACLF后3h、6h、12h或24h给予EP治疗能显著延长ACLF大鼠的生存时间分别至162h、120h、102h及78h。实验结果证实：丙酮酸乙酯(EP)能通过有效抑制HMGB1的表达,降低炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-10及IL-18的水平,减少肝组织内炎性细胞的浸润,改善肝细胞损伤,提高存活率,保护ACLF大鼠。提示EP可作为严重肝功能损伤的新的潜在治疗药物。