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研究背景及目的:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是威胁男性健康的常见疾病之一,尤其对于年龄超过50岁的男性,其发病率呈指数增长。与欧美等发达国家相比,我国前列腺癌发病率较低,2002年的年龄标化发病率为1.6/10万,远低于美国的124.8/10万,但近年来随着经济增长,人口老龄化进程加速,以及生活习惯的不断西方化,我国前列腺癌的发病率也呈现快速增加趋势。然而迄今为止,前列腺癌的发病机制并未完全研究明晰,且前列腺癌发病隐匿,临床早期症状不典型,同时基于我国国情以前列腺特异性抗原(Prostate Specific Antigen,PSA)为基础的早期前列腺癌筛查活动在全国推广较困难,临床上大约1/3患者在确诊时已经发现局部浸润或(和)远处转移,从而失去根治机会,回顾性病例分析显示前列腺癌发病中位年龄在72岁左右,考虑患者预期寿命及身体状态,临床多采用以内分泌治疗为主的综合治疗方案以延缓疾病进展和改善患者相关不适症状。自从1940年Huggins和Hodges证明雄激素撤退治疗(Androgen Deprivation Therapy,ADT)对前列腺癌的明确治疗效果以来,其一直作为前列腺癌系统治疗的主要方案,虽然患者经过12-30个月治疗敏感期后最终都将不可逆的发展为趋势抵抗性前列腺癌(Castration Resistant Prostate Cancer,CRPC)但雄激素受体信号通路始终保持激活状态,这就提示该信号通路中及下游相关物质的表达是前列腺癌发生和发展的重要依据。我们前期试验已经证实雄激素可以上调AQP9在前列腺的表达,且AQP9表达水平与体内雄激素水平之间表现出联动关系,进而我们推测前列腺上皮细胞只有在雄激素作用下维持AQP9的定量表达及保持细胞渗透环境平衡的条件下才能存活。而前列腺癌细胞是否也表现出相似的生物学特性以及干扰AQP9基因表达后是否影响癌细胞存活,关于这方面的报道却很少,本实验正是基于此背景下展开的关于前列腺癌细胞AQP9表达定位情况及干扰其在癌细胞表达后对癌细胞增殖及凋亡影响的研究,并初探讨AQP9表达通路及其与细胞凋亡之间的联系,从而为前列腺癌在基因水平寻找新的治疗方向和靶点提供一定的理论基础。目的:(1)体外培养前列腺癌细胞株pc-3,并检测AQP9蛋白在pc-3细胞株中表达水平及定位情况,揭示pc-3细胞株中AQP9蛋白基本特点。(2)化学合成针对人AQP9(human,h)的小片段干扰RNA(small interference RNA,si RNA)并干扰pc-3细胞AQP9基因的表达,分别从转录和翻译水平检测基因下调情况,并研究干扰后的前列腺癌pc-3细胞株生物学行为变化如细胞增殖活性、细胞凋亡等,进而初步探讨以AQP9基因作为治疗靶点的前列腺癌基因治疗的新策略的可行性。材料与方法:(1)体外培养前列腺癌细胞株pc-3,分别采用细胞免疫荧光技术及western blot检测AQP9蛋白在pc-3细胞株中表达定位情况,并以人正常肝组织中AQP9蛋白作为阳性对照。(2)根据si RNA设计原则由试剂公司(SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY,INC)设计合成并发挥高效抑制作用的AQP9 si RNA(h)。培养前列腺癌细胞株pc-3至细胞融合度达到60-80%时,采用脂质体2000(lipofectamine 2000)介导的瞬时转染方法将AQP9 si RNA(h)转染入前列腺癌细胞株pc-3中,观察转染效果,实验分为空白对照组(control)、实验组(si RNA)、Mock对照组(lipo2000),通过荧光定量PCR及western blot检测AQP9 m RNA及蛋白在pc-3细胞三个处理组之间表达水平的变化。(3)分别采用MTT法及流式细胞仪技术检测三个处理组pc-3细胞增殖活性及细胞凋亡情况。结果:(1)细胞免疫荧光及western blot显示两种前列腺癌细胞株pc-3及LNCap中均有AQP9蛋白表达,且细胞免疫荧光显示AQP9蛋白主要表达于细胞质中,western blot显示AQP9蛋白分子量约26-34KDa,并且在pc-3及LNCap细胞中相 对表达量分别为0.90±0.01,0.57±0.01,人正常肝组织AQP9蛋白相对表达量为8.1±0.01,肝组织中表达量最高,两种癌细胞株间pc-3细胞株内表达水平较高,差异具有统计学意义(P<0.01)。(2)AQP9 si RNA(h)瞬时转染前列腺癌pc-3细胞株48小时后,各处理组AQP9 m RNA相对表达量分别为:control(6.77±0.39),si RNA(0.12±0.02),lipo2000(6.67±0.30);AQP9蛋白相对表达量分别为:control(0.109±0.001),si RNA(0.0363±0.02),lipo2000(0.12±0.011),结果显示转染组前列腺癌pc-3细胞株在m RNA及蛋白水平AQP9表达量均较其他两组下降,单因素方差分析结果提示si RNA与control及lipo2000之间差异均有统计学意义(P<0.05),并且在m RNA水平存在显著性差异(P<0.01),而control与lipo2000之间比较无显著性差异(P>0.05)。(3)MTT法检测瞬时转染前列腺癌pc-3细胞株48小时后各处理组癌细胞生长抑制率,结果显示以空白对照组(control)为参照,转染组(si RNA)癌细胞生长明显受抑制,抑制率为43.6%,Mock对照组(lipo2000)抑制率几乎为0,各组细胞在450nm处吸光度分别为:control(0.58±0.08),si RNA(0.32±0.03),lipo2000(0.61±0.11),单因素方差分析结果提示si RNA与control及lipo2000之间差异均有统计学意义(P<0.05),而control与lipo2000之间比较无显著性差异(P>0.05)。(4)流式细胞术检测瞬时转染前列腺癌pc-3细胞株48小时后各处理组癌细胞凋亡率,结果显示转染组(si RNA)癌细胞凋亡率明显增加,凋亡率为4.63%±0.09%,较空白对照组(control)1.6%±0.15%及Mock对照组(lipo2000)1.61%±0.05%差异具有显著统计学意义(p<0.01),而空白对照组和Mock对照组之间比较无显著性差异(p>0.05)。结论:(1)AQP-9在两种前列腺癌细胞株中均有表达,且主要表达于细胞质,但pc-3细胞株AQP9表达水平高于LNCap细胞株,可能与pc-3细胞株高代谢活性有关。(2)RNA干扰(RNAi)技术可特异性沉默前列腺癌pc-3细胞株AQP9基因在m RNA及蛋白水平的表达。靶向沉默pc-3细胞株AQP9基因表达后,癌细胞的增殖活性明显受抑制并可诱发凋亡,早期凋亡率明显增加,进而设想以AQP9为靶点的前列腺癌基因治疗的可能性。