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目的：从孕龄15天Sprague-Dawley(SD)胎鼠皮质分离、培养获得大量神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)，通过免疫荧光技术鉴定其特性。将传代培养的NSCs移植到大脑中动脉缺血(middlecerebralarteryocclationMCAO)再灌注大鼠脑中，比较移植前后大鼠的行为功能变化，并在体检测移植NSCs的存活迁移情况，观察移植前后梗死区边缘神经细胞的变化，初步探索NSCs移植治疗脑梗死的可行性。
方法：一、细胞培养：1、原代细胞培养：分离孕龄15天SD胎鼠皮质，制作细胞悬液，调整细胞密度为1×106个细胞/ml，接种到含基础培养基的培养瓶中，加入终浓度均为20ng/ml的bFGF、EGF，置培养箱进行原代培养，倒置显微镜下观察细胞生长及分化的形态学变化。2、传代培养：将原代培养形成的细胞球尽可能机械吹打成单细胞悬液，以1：2的比例传代，按上述方法进行培养并观察。3、NSCs的体外分化：将原代或传代培养7d的细胞球吹打成单细胞，离心换液为含10％FBS的基础培养液培养，镜下观察细胞分化情况。二、脑梗死模型的制备及评价：选用250～300g健康雄性SD大鼠，线栓法制备MCAO再灌注模型，麻醉清醒后依据Zea-Longa5分评分制对大鼠神经功能进行评分，筛选符合2～3分的模型后，再依据Garcia的18分评分法对以上模型进行评分、记录。三、细胞移植：用终浓度为50μM的BrdU标记二次传代培养3d时的NSCs，标记48h后将形成的较多细胞球尽量吹打成单细胞，调整其密度达106/μl，取1μl细胞悬液，立体定向注射到脑梗死大鼠纹状体中。四、移植后行为功能评分：移植后观察大鼠的神经功能变化，并于移植后2w、4w时依据Garcia的18分评分法对各组大鼠的神经行为功能进行评分，结果做统计处理。五、免疫和病理学检测：1、取原代或传代培养7d的细胞球加入神经巢蛋白(Nestin)单克隆抗体，行NSCs增殖特性的免疫荧光鉴定；2、原代或传代培养3d的NSCs经BrdU标记48h后，行BrdU标记的鉴定；3、取分化培养7d的NSCs，行NSCs分化的免疫荧光鉴定；4、MCAO再灌24h后，取大鼠脑行TTC和冰冻切片HE染色鉴定；5、移植后2w、4w时，取各组大鼠脑灌注固定，石蜡包埋、切片，分别行Anti-BrdU、Anti-GFAP及Anti-β-Ⅲ-tubulin免疫组织化学染色，跟踪检测移植的NSCs在脑内的存活、迁移情况及移植前后梗死区边缘神经细胞的变化。
结果：一、1、原代培养细胞观察及克隆形成：接种早期细胞胞体较小呈圆形，随着时间的延长，细胞有聚集生长的趋势并出现分裂相，渐形成小的细胞集落，7d时即可形成较大、较多的克隆球。2、传代细胞能形成与原代相似的细胞球，并可继续传代培养。3、原代或传代培养7d的干细胞经免疫荧光染色，形态各异，nestin表达阳性，BrdU标记阳性，诱导分化后免疫荧光显示β-Ⅲ-tubulin、GFAP反应阳性。二、MCAO复灌大鼠手术苏醒后表现为患侧Horner综合征及对侧偏瘫症状。TTC染色可见正常脑组织呈深橙红色，梗死区未被染色而呈白色。HE染色示梗死区的细胞核固缩，核仁消失，细胞数目减少；梗死区边缘的细胞胞体肿大，细胞边界模糊。三、移植后的行为功能变化：NSCs移植到局灶性脑缺血大鼠纹状体以后2w、4w时，移植NSCs组大鼠的神经功能缺损症状得到逐步改善，评分明显高于对照组，有显著性差异，且4w时神经功能恢复明显优于2w时。四、移植后免疫组织化学染色结果：①能够检测到存活的BrdU阳性细胞，阳性细胞多成簇密集分布在针道周围，胞核较大呈圆形，核染色较深呈棕黄色，胞体不着色。另外，在靶位点背侧的胼胝体处，也检测到了散在分布的BrdU阳性细胞。且随着时间的延长，移植后4w时可见移植细胞向周围迁移、分化参与血管形成，并可见梗死区边缘微血管明显增生。②Anti-GFAP免疫组化染色结果显示，在三组梗死区边缘均能检测到阳性细胞，但移植组大鼠脑阳性细胞数目较另两组明显增多，阳性细胞胞体多呈三角形、较正常肥大，突起染色深，多而细长，并且在梗塞灶边缘相互交织成密集的网，其纤维末端有向梗塞灶的中央延伸的趋势。③Anti-β-Ⅲ-tubulin免疫组织化学染色结果显示，在三组大鼠脑梗死区边缘均能够检测到阳性细胞，其胞体多呈圆或椭圆形，具有一或两个长突起，突起着色呈棕黄色，核大而圆不着色。
结论：1.本实验分离、培养的孕龄15天SD胎鼠皮质细胞Nestin表达阳性，BrdU标记阳性，分化后表达神经元和星形胶质细胞的标记物，是大鼠的NSCs。2.体外培养的NSCs，立体定向移植到脑梗死大鼠的纹状体以后，在移植后不同时间点(2w、4w)，大鼠的神经功能缺损症状得到逐步明显改善。3.免疫组织化学染色显示，能够在神经功能明显改善的大鼠脑内检测到存活、迁移、分化的供体细胞及在梗死区边缘大量增生的星形胶质细胞、微血管，表明移植的NSCs能在脑梗死大鼠脑内存活、迁移、分化，并且对脑梗死大鼠的神经功能修复起到了积极作用。