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异基因造血干细胞移植是目前治疗来源于造血干细胞的恶性克隆性疾病的重要治疗手段,广泛应用于临床。移植后的巨细胞病毒感染,移植物抗宿主病等发生率和死亡率都很高,使得移植成功率降低。如何减轻这些移植后并发症提高异基因造血干细胞移植的效率是目前血液病学家和免疫学家共同关心的问题。
第一部分抢先治疗异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的临床分析
[目的]回顾性研究异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后抢先治疗对巨细胞病毒(CMV)感染的临床意义。[方法]收集上海市第一人民医院2001-2008年间进行异基因干细胞移植治疗的患者共计103例,采用荧光定量PCR法检测CMV-DNA,并根据结果抢先治疗CMV相关疾病,分析抢先治疗对于阻止CMV血症发展为CMV相关疾病的意义。[结果]103例患者中检测出63例次(51例)CMV-DNA阳性,发生率为49.5％,经抢先治疗19例发生CMV相关疾病,发生率为18.4％。60例次CMV血症经更昔洛韦和(或)鳞甲酸治疗转阴,1例不可评价疗效,治疗的总有效率为96.8％(60/62)。CMV相关疾病的治疗总有效率为89.5％(17/19),2例患者因CMV相关肺炎伴急性移植物抗宿主病(aGVHD)而死亡,CMV相关疾病的直接死亡率为1.9％(2/103)。[结论]在不进行预防性治疗的前提下,CMV血症和CMV相关疾病发生率未见升高。
第二部分抗原特异性记忆T细胞不引起GVHD及其机制研究
[目的]移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后的另一种常见并发症,由供者T淋巴细胞介导,其发病率和死亡率都很高,严重影响患者的生活质量。如何在减轻GVHD的同时保存T细胞的GVL功能是目前研究的热点。几个研究小组都证实非抗原特异性记忆T细胞不引起GVHD,然而对于抗原特异性记忆T细胞在GVHD中的作用却少有研究。本实验目的即为研究抗议特异性记忆T细胞在GVHD中的作用。[方法]建立野生型动物模型和转基因动物模型来研究抗原特异性记忆T细胞在GVHD中的作用。应用TEa→CB6目的GVHD模型研究抗原特异性记忆T细胞不引起GVHD的机制。[结果]建立了两种野生型动物模型,第一个模型是用BALB/c小鼠致敏C57BL/6小鼠,8周后从C57BL/6小鼠分选出CD62L-TEM移植给BALB/c受鼠,与CD62L+初始T细胞相比,CD62L-TEM细胞引起较弱的GVHD。第二个模型是用C3H/HeJ小鼠致敏C57BL/6小鼠使其受孕,从C57BL/6怀孕母鼠体内分选出的记忆T细胞移植给C3H/HeJ小鼠也只能引起较弱的GVHD。用转基因的TEa小鼠建立了TEa→CB6目的GVHD模型,TEa小鼠中大部分T细胞为CD4+T细胞,特异性识别ASFEAQGALANIAVDKA肽段,此肽段表达在CB6F1小鼠细胞上。将初始TEa细胞转输至Rag-1-/-小鼠体内,然后用CB6F1小鼠的脾细胞进行免疫,8周后转输的TEa细胞获得记忆T细胞表型(即CD44highCD45RB-CD127+CD11abright FasL bright Ki67-CD28-KLRG-),其中93％为CD62L-CD44high TEM表型,7％为CD62L+CD44high TCM表型。将TEM细胞纯化出来,与抗原特异性T细胞或特异性抗原肽进行混合淋巴细胞反应。并观察抗原特异性T细胞是否引起GVHD,同时进行异基因抗原皮肤移植,对抗原特异性记忆T细胞进行体内追踪。TEM细胞cpm值明显高于初始TEa细胞,TEM细胞增殖更快更强。如果移植CB6F1小鼠皮肤到产生TEM细胞的Rag-1-/-小鼠(TEM小鼠),TEM组皮肤移植物于7天至12天排斥,中位生存时间为9天；初始TEa动物组皮肤移植物7天至23天排斥,中位生存时间为10天,两组生存率比较差异显著(p<0.05)。为了研究TEM在GVHD中的作用,将1×105TEM细胞与1×107去除T细胞的骨髓一同移植至致死量照射的CB6F1受鼠,生存分析表明接受TEM细胞移植组小鼠100天生存率100％,而初始TEa组小鼠35天内全部死亡,两组生存率有明显差异；体重变化曲线显示在第7、14及21天初始TEa受鼠组与TEM受鼠组相比体重下降明显(p<0.01)。移植后第7天进行细胞因子检测,接受初始TEa细胞移植的GVHD受鼠血浆中IL-2、IL-3、IL-12P40、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IL-1a、IL-1b、MIP-1a、MIP-1b、RANTE、MCP-1、KC、Eotaxin、G-CSF和GM-CSF的水平明显高于接受TEM细胞移植的GVHD受鼠(p<0.05)。体外混合淋巴细胞培养显示TEM在培养的前期cpm值高于初始TEa细胞,而培养后期TEM的cpm值低于初始TEa。CFSE标记效应细胞后进行AnnexinV和7-AAD流式检测发现,TEM细胞与初始T细胞相比早期凋亡与晚期凋亡均显著增加,这种趋势不依赖于IL-7的存在。对移植到CB6F1小鼠体内的TEM细胞进行追踪,分别收集骨髓,肝,脾及淋巴结内的淋巴细胞,移植后7天检测不到TEM细胞,相反能够检测到大量的初始T细胞；与此相对的是皮肤移植受体内直到移植后84天仍然能够检测到TEM细胞。[结论]用TEa,转基因小鼠建立的研究抗原特异性TEM在GVHD中作用的模型证实了抗原特异性TEM不会引起GVHD,移植后7天小鼠体内细胞因子检测显示初始TEa细胞移植组Th1和Th2类细胞因子明显高于抗原特异性TEM细胞移植组,体外细胞培养显示TEM细胞更快凋亡,体内检测证实TEM不能单独在GVHD受鼠体内长期存活。