干旱是影响植物正常代谢和生长发育最主要非生物胁迫因子之一，对我国城市绿化建设和农业发展有着严重的影响。脱水素和CBF转录因子分别是植物在干旱胁迫应答过程中产生的功能性蛋白和调节性蛋白，它们在植物抗旱过程中起着重要的作用。但是目前有关它们在植物抗旱基因工程中应用的资料还很缺乏，尚需要进一步深入研究。本研究从荠菜中克隆了一条新的脱水素基因(cor29)，并采用农杆菌转化法将cor29基因和CBF基因Cbcbf25的全长eDNA转入烟草，以期为植物的抗旱基因工程研究提供依据和参考。本研究的主要结果如下：1．荠菜脱水素基因cor29全长cDNA的克隆及其特征分析本研究采用序列同源克隆策略，结合RACE技术从荠菜中克隆出了一个新的脱水素基因的全长cDNA序列，命名为cor29(GcnBank，AY513787)。该cDNA全长1110 bp，包含了1个783 bp的开放阅读框(ORF)，编码261个氨基酸。根据核苷酸序列推导的蛋白(COR29)的分子量(Mw)为29．36 kD，等电点pⅠ为4.93。氨基酸序列的结构分析显示COR29具有脱水素家族的几个典型特征。首先COR29蛋白具有高比例的亲水性氨基酸组成，具有较强的亲水性。第二，序列中具有3个为脱水素家族高度保守的K-片断(K-segment)。另外，序列的中部位置有一个连续的丝氨酸束，即S-片段(S-segment)，且位于第一个K-片断之前。BLAST搜索(EXPASY／UniProt)结果表明COR29蛋白与大多数已知的脱水素具有较高的同源性。结构与功能分析表明COR29蛋白在干旱环境胁迫下可通过其丰富的亲水性氨基酸和可形成兼亲性a-螺旋的K-片段保护细胞免受脱水伤害。半定量RT-PCR结果表明cor29基因的表达受外源性ABA、干旱或低温胁迫的影响。推测cor29基因的表达至少存在着两条途径：一条是依赖于ABA但不需要特殊蛋白合成的信号传导途径Ⅱ，另外一条是不依赖于ABA的信号传导途径Ⅳ。2．cor29和Cbcbf25全长cDNA的植物表达载体构建本研究采用pCAMBIA2301作为所克隆基因的表达载体骨架，将采用EcoRⅠ/minⅢ双酶切从pBI121质粒上切下的gus基因表达盒连接到用同样双酶切开环的pCAMBIA2301的多克隆位点中，形成中间载体p2301-gus。插入的gus表达盒的CaMV 35S启动子后面可供采用的酶切位点有3个，它们依次是XbaI、BazrBI和XmaI／SmaI，终止子前面可供采用的酶切位点为SacI。设计带有所需酶切位点序列的PCR引物，从植物总cDNA分别扩增获得目基因片断。经测序验证正确后，带相应目的基因片断的pGEM-T Easy载体采用相应限制性内切酶进行完全双酶切，分别回收获得带BaaBI／SacI粘性末端的cor29全长cDNA片断和带XmaI／SacI粘性末端的Cbcbf25全长cDNA片断。同时对载体p2301-gus分别采用BamHI／SacI和XmaI／SacI双酶切，切下gus基因后回收载体骨架。将对应的载体骨架与目的基因进行连接，即可得到分别携带cor29和Cbcbf25基因全长cDNA的植物表达载体p2301-cor29和p2301-Cbcbf25。将其先转化大肠杆菌，再转化根癌农杆菌。此外，我们构建了适合遗传转化单子叶植物的表达载体pDB-Cbcbf25，目的基因Cbcbf25由玉米泛素Ubi启动子驱动，hpt基因作为选择标记基因，可用来遗传转化单子叶植物。3．cor29和Cbcbf25全长cDNA采用农杆菌转化法转化烟草的研究本研究采用含有植物表达载体p2301-cor29和p2301-Cbcbf25的根癌农杆菌菌株EHA105进行烟草转化的叶盘法操作，经过共培养、诱导不定芽、生根移栽后分别获得转cor29基因的再生苗35株和转Cbcbf25基因的再生苗23株。对这些再生苗进行叶片卡那霉素抗性鉴定的结果表明：在转cor29基因的再生苗中，有完全抗卡的6株，部分抗卡的6株，完全不抗卡的23株；在转Cbcbf25基因的再生苗中，有完全抗卡的5株，部分抗卡的3株，完全不抗卡的15株。对叶片kan抗性检测呈完全阳性的再生植株进行目的基因(cor29或Cbcbf25)和nptⅡ基因的PCR检测，均扩增出了阳性条带。结果初步表明荠菜的脱水素基因cor29和CBF基因Cbcbf25已经整合到烟草基因组之中。