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目的本研究以TX小鼠和人脐静脉血内皮细胞(human umbical vein endothelial cells,HUVECs)为研究对象,以体内和体外实验相结合方式,研究中药肝豆灵对肝豆状核变性(Wilson’s disease,WD)患者脑血管的保护机制。阐明WD脑血管损害的机制与内质网应激PERK/e IF2α/CHOP信号通路介导的细胞凋亡有关,中药肝豆灵可过调控内质网PERK/e IF2α/CHOP信号通路抑制细胞凋亡,从而发挥保护WD脑血管损害作用。通过研究肝豆灵保护WD脑血管损害的分子机制,为肝豆灵临床应用提供理论基础和科学依据,为中医药防治WD脑血管损害提供新的思路。通过体内实验观察肝豆灵干预内质网应激PERK/e IF2α/CHOP信号通路对WD模型TX小鼠脑血管的保护作用;并通过体外实验HUVECs模拟脑血管内皮细胞进一步验证肝豆灵通过干预内质网应激PERK/e IF2α/CHOP信号通路对铜负荷后的HUVECs的保护机制;探讨肝豆灵对WD模型TX小鼠脑血管保护的作用机制。方法体内实验——肝豆灵对TX小鼠脑血管保护机制的探讨:48只TX小鼠随机分为模型组、肝豆灵组、青霉胺组、肝豆灵加青霉胺组、另外12只DL小鼠作为对照组。分别观察各组小鼠血清血管损伤因子v WF、TM、ACA的变化;观察各组小鼠的脑血管病理形态变化;选用免疫组化法观察小鼠血管内皮细胞损伤因子ICAM-1、VCAM-1、GRP78表达;选用TUNEL法观察各组小鼠脑血管内皮细胞凋亡情况;选用Western Blot法观察各组小鼠脑组织中内质网应激PERK信号通路关键蛋白表达结果。体外实验——肝豆灵对铜负荷HUVECs保护机制探讨:实验中设计共分为6组,为正常组、对照组、肝豆灵低剂量组、肝豆灵中剂量组、肝豆灵高剂量组、Salubrinal组。流式细胞仪观察肝豆灵对铜负荷诱导的各组HUVECs凋亡的影响;RT-q PCR法观察肝豆灵对铜负荷诱导的各组HUVECs内PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA表达的影响;Western Blot法观察肝豆灵对铜负荷诱导的各组HUVECs内PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白表达的影响;比色法观察肝豆灵对铜负荷诱导的各组HUVECs内caspase-3活性的影响。结果体内实验——肝豆灵对TX小鼠脑血管保护机制的探讨:(1)血清血管损伤因子:与对照组比较,模型组小鼠v WF、TM、ACA数值明显升高,有显著统计学差异(P<0.01);与模型组比较,肝豆灵组v WF、TM、ACA数值均下降,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,青霉胺组v WF、TM、ACA数值有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,肝豆灵组加青霉胺组v WF、TM、ACA数值明显下降,有显著统计学差异(P<0.01)。(2)脑血管组织病理学改变:与对照组比较,模型组脑血管内皮细胞出现水肿变性,而对照组脑血管内皮细胞未见明显水肿变性,结果表明模型组发生了脑血管的损伤。与对照组相比,GDL组和青霉胺组的病理形态学改变显示脑血管内皮细胞轻度水肿变性。提示肝豆灵和青霉胺对脑血管损伤有改善作用,且肝豆灵和青霉胺联合治疗对WD小鼠脑血管的保护效果最明显。(3)免疫组化法观察内皮细胞损伤因子VCAM-1、ICAM-1、GRP78蛋白表达:对照组DL小鼠脑组织切片未见有明显的VCAM-1、ICAM-1、GRP78阳性染色血管;与对照组相比较,模型组TX小鼠有明显的VCAM-1、ICAM-1、GRP78阳性染色血管,镜下观察到表现为血管壁的棕黄色,有显著性统计学差异(P<0.01);与模型组相比较,肝豆灵组、青霉胺组VCAM-1、ICAM-1、GRP78阳性染色血管明显减少(P<0.05);与模型组相比较,肝豆灵加青霉胺组的VCAM-1、ICAM-1、GRP78阳性染色血管表达有显著减少,有显著的统计学差异(P<0.01)。(4)TUNEL法观察内皮细胞凋亡情况结果:对照组DL小鼠脑血管内皮细胞未见有明显的荧光标记;与对照组相比较,模型组有明显的荧光标记,AOD比值有显著性统计学差异(P<0.01);与模型组相比较,肝豆灵组、青霉胺组荧光标记较模型组有减弱,AOD比值有统计学差异(P<0.05);与模型组相比较,肝豆灵加青霉胺组的荧光标记有明显的减弱,AOD比值有显著的统计学差异(P<0.01)。(5)Western Blot法观察PERK信号通路关键蛋白表达:对照组DL小鼠脑血管组织未见有明显的PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白表达;与对照组比较,模型组PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白表达明显升高,有显著性统计学差异(P<0.01);与模型组比较,肝豆灵组、青霉胺组的PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白表达降低,有统计学差异(P<0.05);与模型组比较,肝豆灵加青霉胺组的小鼠脑血管组织PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白表达明显降低,有显著的统计学差异(P<0.01)。体外实验——肝豆灵对铜负荷HUVECs保护机制探讨:(1)流式细胞仪观察HUVECs的凋亡:与正常组相比较,对照组为模拟铜负荷情况下培养HUVECs 24h显著增加HUVECs的凋亡率(P<0.01)。与对照组比较,肝豆灵低、中、高剂量组呈现浓度依赖性的抑制HUVECs的凋亡(P<0.05,P<0.01),特异性e IF2α磷酸酶抑制剂Salubrinal(30?mol/l)可以显著抑制HUVECs的凋亡(P<0.01)。(2)RT-q PCR观察PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA表达:与正常组相比较,对照组为模拟铜负荷情况下培养HUVECs 24h显著增加HUVECs的PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA表达(P<0.01)。与对照组比较,肝豆灵低、中、高剂量组呈现浓度依赖性的抑制HUVECs的PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA表达(P<0.05,P<0.01),特异性e IF2α磷酸酶抑制剂Salubrinal(30?mol/l)可以显著抑制HUVECs的p-e IF2α、CHOP m RNA表达(P<0.01),但对PERK m RNA表达没有干预作用(P>0.05)。(3)Western Blot法观察PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白表达:与正常组相比较,对照组为模拟铜负荷情况下培养HUVECs 24h显著增加HUVECs的PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白表达(P<0.01)。与对照组比较,肝豆灵低、中、高剂量组呈现浓度依赖性的抑制HUVECs的PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白表达(P<0.05,P<0.01),特异性e IF2α磷酸酶抑制剂Salubrinal(30?mol/l)可以显著抑制HUVECs的p-e IF2α、CHOP蛋白表达(P<0.01),但对PERK蛋白表达没有干预作用(P>0.05)。(4)比色法观察caspase-3活性:与正常组相比较,对照组为模拟铜负荷情况下培养HUVECs 24h显著增加HUVECs的caspase-3的活性(P<0.01)。与对照组比较,肝豆灵低、中、高剂量组呈现浓度依赖性的抑制HUVECs的caspase-3的活性(P<0.05,P<0.01),特异性e IF2α磷酸酶抑制剂Salubrinal(30?mol/l)可以显著抑制HUVECs的caspase-3的活性(P<0.01)。结论体内实验:(1)肝豆状核变性模型TX小鼠脑血管存在损伤,血管内皮细胞病理形态发生改变,光镜下内皮细胞不同程度变性及坏死,超微结构发生改变,血管内皮细胞肿胀,同时导致血清中血管损伤因子(v WF、TM、ACA)水平的升高;免疫组化显示血管内皮细胞的损伤因子VCAM-1、ICAM-1表达水平增加。(2)肝豆状核变性模型TX小鼠脑血管存在损伤,血管内皮细胞发生凋亡,并且激活了内质网应激信号通路关键蛋白GRP78的表达。(3)肝豆状核变性模型TX小鼠脑血管内皮细胞凋亡明显增加,内皮细胞中的PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白的表达明显增加,提示脑血管内皮细胞的凋亡可能是通过PERK/e IF2α/CHOP凋亡信号通路介导的。(4)肝豆灵能够改善TX小鼠的脑血管损伤,减轻内皮细胞肿胀,降低血清血管损伤因子(v WF、TM、ACA)水平,减少血管内皮细胞中血管损伤因子VCAM-1、ICAM-1)的表达,减少脑血管内皮细胞的凋亡,减少血管内皮细胞中PERK、p-e IF2α、CHOP、caspase-12、caspase-3蛋白的表达,提示肝豆灵是通过干预内质网应激PERK/e IF2α/CHOP凋亡信号通路对肝豆状核变性模型TX小鼠的脑血管起保护作用的。体外实验:(1)铜负荷可使HUVECs产生损伤,使HUVECs发生凋亡,肝豆灵可降低HUVECs的凋亡率,足量浓度的肝豆灵疗效更佳,对HUVECs的保护作用也更明显。(2)铜负荷诱导的HUVECs的凋亡率明显增加,HUVECs内PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA的表达及PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白的表达、caspase-3活性明显增加,因此HUVECs的凋亡可能通过PERK/e IF2α/CHOP内质网应激信号通路介导。(3)肝豆灵能改善铜负荷诱导的HUVECs损伤,降低HUVECs中PERK、p-e IF2α、CHOP m RNA的表达及PERK、p-e IF2α、CHOP蛋白的表达,降低caspase-3的活性,提示肝豆灵可能是通过PERK/e IF2α/CHOP内质网应激信号通路抑制血管内皮细胞的凋亡,从而发挥对脑血管内皮细胞的保护作用。