论文部分内容阅读
据统计,全球每年由于饮酒造成的死亡人数高达330万,全社会应对饮酒造成的身体伤害给予高度重视并加以预防。长期过量摄入酒精会导致酒精性肝损伤（alcoholic liver disease,ALD）,造成肝脏受损,危害身体。对于ALD的治疗,传统药物治疗或多或少带有一定的肝脏毒性,因此寻找天然抗ALD活性物质仍是研究的热点。马氏珠母贝（Pinctada martensii）富含蛋白质、氨基酸、糖原、维生素、肽类及Se、Zn等微量元素,具有抗氧化、降血压、增强免疫、抗肿瘤和抗ALD等多种生理活性,为了研究马氏珠母贝中是否含有抗ALD活性肽,本实验制备了不同的马氏珠母贝提取物,以急性酒精性肝损伤小鼠模型为指标对各提取物的抗ALD活性进行评价;随后以ADH为配体,通过基于表面等离子体共振（SPR）的Biacore分子对接技术对活性较好的组分进行抗ALD活性肽（受体）筛选,并进行结构鉴定;最后以细胞实验和动物实验对人工合成目标活性肽进行抗ALD活性评价。主要研究内容及结果如下所示:（1）分别采用蒸煮法制备马氏珠母贝肉水提物,酶法结合超滤分级制备马氏珠母贝肉分离蛋白酶解产物及其3组超滤组分,分别为F-Ⅰ（＜3 ku）、F-Ⅱ（3～8 ku）和F-Ⅲ（＞8 ku）,并利用急性酒精性肝损伤小鼠模型,探究以上各组分的抗ALD活性。结果显示,马氏珠母贝肉水提物、各超滤组分均具有较好的抗ALD活性,其中水提物和F-Ⅰ组分抗ALD活性更强,可显著提高酒精代谢酶ADH、ALDH的活性,提高SOD、GSH的抗氧化指标水平（P＜0.01）,降低血清代谢酶AST、ALT活性及脂质代谢中MDA、TG的含量（P＜0.01）,并改善肝脏组织病变,保持细胞的界限完整性及细胞形态。F-Ⅰ组分及水提物氨基酸组成分析表明,在水解氨基酸中,F-Ⅰ组分及水提物中必需氨基酸含量分别占总氨基酸含量的41.06%和29.16%,支链氨基酸占比分别为19.38%、13.81%,疏水性氨基酸占比分别为36.40%、31.47%。F-Ⅰ组分中牛磺酸质量分数为2.71%,水提物中牛磺酸质量分数为5.38%。（2）以ADH浓度为60μg/m L,醋酸钠缓冲液的p H为5.0构建ADH配体偶联CM5芯片,随后对抗ALD活性较好组分进行特异性表征和垂钓实验。结果显示,当水提物和F-Ⅰ组分分别以6 mg/m L和500μg/m L注射到ADH配体芯片表面时,信号值开始增加。Biacore垂钓实验结果表明:F-Ⅰ组分中十八肽VGLTNYAAAYCTGLLLAR及水提物中的十五肽IDQSILTGESVSVIK、十六肽TITLEVEPSDTIENVK、六肽MQIFVK是4种与ADH相结合的活性肽段,可能具有潜在的抗ALD活性。通过固相合成法对以上四种肽段进行了合成,纯度达95%以上。动力学结果表明,随着合成肽浓度（1.56μM～100μM）的上升,Biacore响应值也随之上升,有结合效果。拟合结果为:十八肽、十六肽、十五肽、六肽的平衡解离常数KD值分别为3.11×10-5 M、1.23×10-6M,、6.81×10-6 M、1.16×10-5 M,其中十五肽的结合力最好。体外ADH激活率测定结果表明,十八肽、十六肽在浓度为1.56μM～100μM时ADH激活率呈先增加后减少的趋势,在200μM时达到最佳;十五肽一直呈增加趋势,而六肽的ADH激活率相对最低。（3）用100μM的4种合成肽干预LO2细胞24 h,0.8 M乙醇孵育6 h损伤细胞,随后通过测定细胞内各项指标进行合成肽活性评价。结果显示,与模型组相比,不同合成肽组分均能显著提升乙醇损伤后的LO2细胞活力（P＜0.01）;不同程度上降低LDH、AST活性（P＜0.01）和ALT活性（P＜0.05）;显著降低TG含量（P＜0.05或P＜0.01）、MDA含量（P＜0.05）,减轻脂质过氧化造成的损伤;同时能使酒精损伤后的LO2细胞内SOD及GSH水平显著提升（P＜0.01）。其中十六肽、十五肽组分具有较好的抗酒精性细胞损伤能力。（4）为进一步验证分离鉴定的活性肽抗ALD效果,选取活性最优的十五肽进行抗ALD功效动物实验。结果显示,与模型组对比,十五肽各剂量组可不同程度提高酒精代谢酶ADH、ALDH的活性（P＜0.05）,提高CAT、SOD、GSH的抗氧化指标水平（P＜0.05）,降低血清代谢酶AST、ALT活性、脂质代谢中MDA、TG的含量及CYP2E1含量（P＜0.05）,缓解肝脏组织肿胀、病变,保持细胞的界限完整性及细胞形态,十五肽中剂量组具有显著的抗ALD功效,而低剂量组和高剂量组在某些指标测定上无显著性差异。因此,可以认为十五肽中剂量组具有较显著的保护作用,能调整小鼠体内抗氧化系统,减少肝脏中CYP2E1的含量,减轻氧化应激反应,缓解酒精对肝脏造成的损伤。