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恶性肿瘤在我国已成为导致人们死亡的第一位疾病,要攻克肿瘤,诊断是关键的一步,现有的肿瘤诊断和筛查技术要么价格昂贵、要么灵敏度低,往往是在肿瘤发生到一定阶段才能发现,存在严重不足。一种解决思路是利用抗原抗体反应的特异性,研发一种新型免疫磁性微球,将其作为肿瘤标志物的捕获探针,对人体血液或体液中的肿瘤标志物进行捕获,再利用放大探针将捕获的标记物信号进行放大并检测,以期能进一步提高肿瘤标志物检测的灵敏度,简化检测步骤,降低检测成本。本课题组对上述思路中的免疫磁性微球进行制备,以人源IgG模拟肿瘤标志物,采用2～3μm功能化磁性微球与抗体偶联,制备了具有结合活性的免疫磁性微球。采用125I标记抗原及抗体,通过对放射性同位素的检测对偶联工艺进行定量评价,考察了各影响因素对抗体偶联效果的影响。对所制备的免疫磁性微球进行了初步性能评价。市售磁性微球表面功能基数量少,品种单一,限制了磁性微球的进一步多功能化。多糖微球表面功能基团种类丰富,易于改性,且表面功能基团分布密集,可以引入更多抗体。我们以普鲁兰为例,优化多糖微球的合成条件,对免疫微球的进一步改进打下基础。磁性微球可以通过磁场富集,用于体外检测试剂载体,在疾病诊断上有重要用途。也可用于药物载体,通过磁场定位达到靶向给药的目的。为了拓展体内检测试剂载体的研究,我们设计合成一类具有pH/温度双重敏感性的、可生物降解的两亲性聚丙烯酰胺衍生物-co-聚氨基酸聚合物,通过高分子自组装的方法形成纳米微球,作为下一步合成多重靶向药物载体的前期基础。本文具体研究内容如下:一、磁性微球与抗体的偶联方法的考察选用2～3μm SiO2磁性微球,分别连接有不同间隔臂的胺基、羧基等功能基,与带有荧光标记的抗体通过不同的方法进行偶联,再与带有荧光标记抗原进行吸附,通过激光共聚焦检测偶联情况,对磁球与抗体、抗体偶联情况进行定性研究。选定出工艺简便、偶联效果好的偶联方法。二、磁性微球-抗体与抗原吸附定量考察及其稳定性考察采用放射性同位素标记的方法进行定量研究。对选定的偶联方法进行进一步工艺优化,得出最佳的偶联条件,并对免疫磁性微球进行稳定性考察。在此基础上逐步降低抗原的浓度,确定抗原最小检测浓度。三、蛋白G定向偶联磁性微球与抗体的工艺研究EDC化学偶联方法是将抗体无规则地连接在磁性微球上,而采用蛋白G可通过对IgG的Fc区的结合,实现抗体与磁性微球的定向偶联。考察抗体定向偶联条件,并研究了pH值对抗体检测回收率的影响。四、普鲁兰微球的制备工艺的考察以正庚烷-四氯化碳为油相、Span-80为乳化剂,采用反相乳化法制备粒径可控的普鲁兰微球。考察普鲁兰浓度、水油比、搅拌速度、乳化剂用量等因素对微球的大小、形态的影响。为下一步制备各种功能化磁性微球并与SiO2微球进行比较研究,奠定实验基础。五、温度PH敏感性材料P（NiPAAm-co-DMAA）-co-P（L-Ala）的制备通过原子转移自由基聚合（ATRP）合成一种带有活性-NH2基团的温度敏感性亲水型共聚物P（NiPAAm-co-DMAA）,并将其作为引发剂,引发丙氨酸的阴离子聚合。所合成的P（NiPAAm-co-DMAA）-co-P（L-Ala）的PDI在1.3左右。聚合物可以通过自组装的方式形成纳米胶束。利用透射电镜（TEM）研究了胶束的粒径分布和形态。结果表明,胶束大小在200～300nm左右,具有明显的核壳结构。共聚物的最低临界溶解温度（LCST）为45.5℃。温度低于LCST时,聚合物溶解形成胶束;高于LCST时,胶束解离,聚合物不溶。聚合物对温度的响应是快速而可逆的。综上所述,本论文制备了免疫磁性微球,并讨论了磁性微球上的功能基团、偶联剂、间隔臂、以及其他实验因素对偶联效果的影响,其抗体偶联量最高为31.33±2.16μg/0.1mg磁性微球,抗原吸附量最高为34.78±0.36μg/0.1mg磁性微球。所制免疫磁性微球对人源IgG的检测极限水平可达50pg/ml,对人源IgG吸附率为65.96±6.99%。且稳定性较好,在37℃60转/分钟摇动条件下存放5天,抗体脱落量仅有13%。考察了蛋白G法定向连接抗体工艺,其抗体连接量最高为1.26±0.03μg/0.1mg磁性微球,抗原吸附量为2.45±0.10μg/0.1mg磁性微球。相比非定向化学连接工艺来说,定向连接工艺的抗体利用率较高,可有效地结合抗原,但抗体连接量较低。本实验为免疫磁性微球在肿瘤标记物早期诊断方面的应用提供了参考。另外,本论文还研究粒径可控的普鲁兰微球以及温度pH敏感纳米胶束P（NiPAAm-co-DMAA）-co-P（L-Ala）的制备工艺,为下一步制备多功能化检测载体提供了参考。