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目的神经退行性疾病是一类以中枢神经系统神经元进行性损伤及死亡导致运动功能障碍和认知功能受损为特征的一类疾病。神经退行性疾病已成为第四位死亡原因。帕金森氏病(Parkinson’s Disease, PD)作为常见的神经退行性疾病之一已在世界范围内严重影响人类的健康及经济状况。虽然针对PD的基础研究及临床实验众多,但其发病机制至今未明。近年线粒体功能障碍导致多巴胺能神经元死亡被不断发现在PD病理过程中发挥重要作用,特别与家族性常染色体隐性遗传的早发性帕金森氏病(autosomal recessive early-onset Parkinson’s disease)关系密切。Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10 (PTEN)-induced putative kinase 1 (PINK1)基因为PD相关基因,在线粒体的质量控制方面发挥重要功能,如识别功能受损的线粒体并介导其降解。PINK1功能障碍导致线粒体异常堆积、多巴胺能神经元死亡等多种PD特征性病理改变。前期研究表明转录调节因子NFκB参与调节UCHL1, USP24和RNF11等PD相关基因的转录和表达,在PD的发病过程中发挥重要作用。本研究在前期研究基础上以人类PINK1基因为研究对象,研究转录因子NFκB对PINK1基因的转录调控及其分子机制。材料和方法1.用5’端-末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE)中的基于模板跳转的反转录(Switching Mechanism At 5’End of RNA Transcript, SMART) RACE技术检测PINK1基因的转录起始位点(Transcription Start Site, TSS)。2.根据TSS结果克隆人类PINK1基因启动子不同区域序列驱动的重组荧光素酶报告基因质粒,用双重荧光素酶报告分析系统(Dual-Luciferase Reporter Assay system)检测不同重组质粒的荧光活性从而评估启动子活性,通过启动子缺失分析(deletion analysis),找出核心启动子区(core promoter)。3.利用Genomatix及TFSearch在线软件分析人类PINK1基因功能启动子区可能结合的转录因子(Transcription Factor, TF)。根据结合参数进行筛选分析。合成转录因子NFκB结合位点寡聚核苷酸探针及PINK1基因中可能结合NFκB的寡聚核苷酸序列,提取过表达NFκBp65的核蛋白,采用电泳迁移率实验(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)对预测的转录因子NFκB结合位点的有效性进行验证。4.在不同细胞系(HEK293, SH-SY5Y, N2a)共转染NFκB p65的表达质粒pMTF-NFκB p65及含有PINK1功能启动子的重组荧光素酶报告基因质粒pPINK1-A,采用Luciferase assay技术研究高表达NFκB p65蛋白对PINK1启动子活性影响。5.在HEK293细胞中高表达NFκB p65蛋白,分别用半定量反转录PCR (semi-quantitative reverse transcription-PCR, rt-PCR)及蛋白免疫印迹技术(Western blot, WB)检测NFκB p65对人类PINK1基因在转录水平及翻译水平的影响。同时在SH-SY5Y细胞中高表达NFκB p65蛋白或诱导内源性NFκB活化,用WB检测转录因子NFκB对PINK1基因在翻译水平的调控。结果1.用SMART-RACE方法和基因特异性扩增技术获得长约650bp长核酸片段,将其克隆进pcDNA4/myc-His载体,测序分析结果显示与外源SMARTer ⅡA Oligonucleotide相接的首个碱基为PINK1基因翻译起始位点(Translational Start Site, ATG)上游91bp处的腺嘌呤A(Adenine)。2.扩增PINK1基因启动子区-1799至+26共1825bp区域内不同长度序列,所有片段构建入载体pGL3-basic形成重组荧光素酶报告基因质粒pPINK1-A至pPINK1-I共9个。荧光活性检测结果显示pPINK1-A的相对荧光素酶活性为(113.47±10.63 RLU)。删减分析结果显示pPINK1-G的相对荧光素酶活性为(78.44±4.74 RLU),进一步删减所得质粒pPINK1-H的相对荧光活性明显降低。3.以在线软件Genomatix及TFSearch为工具对PINK1基因启动子区-1799至+1进行转录因子预测分析,以结合系数90%为阈值进行筛选,结果显示人类PINK1基因启动子区含有AP1, MEF, cAMP-反应原件等,并含有4个NFκB转录因子结合位点分别命名为PINK1-NFκB-1/2/3/4。EMSA实验结果显示NFκB p65蛋白主要与PINK1-NFκB-1寡聚核苷酸产生竞争性结合。4.在HEK293, SH-SY5Y及N2a三细胞系共转pMTF-NFκB p65质粒及pPINKl-A质粒,结果显示人类PINK1基因启动子活性在NFκBp65过表达情况下分别提高了3.43±0.55、2.11±0.10、1.63±0.01倍(P<0.01)。5.在HEK293细胞中瞬时转染pMTF-NFκB p65质粒,rt-PCR结果显示相较于空质粒pMTF,转染pMTF-NFκB p65质粒细胞的内源性PINK1 mRNA水平升高了59.51%±15.13%(p<0.01),WB显示全长PINK1 (FL-PINK1)蛋白表达强度增加至214.53%±38%(P<0.01)。在SH-SY5Y细胞中,NFκB p65蛋白过表达使三种不同分子量的PINK1相关蛋白(FL-PINK1,Δ1-PINK1,Δ2-PINK1)表达分别增加45.26%±19.58%,41.10±6.70%及48.54±4.50%(p<0.01)。用LPS以25ng/ml浓度处理SH-SY5Y细胞16小时后,FL-PINK1,Δ1-PINK1及A2-PINK1表达分别增加了26.77%±2.33%,24.46土2.59%及83.57±4.60%p<0.001)。结论1.人类PINK1基因主要的转录起始位点为其翻译起始位点ATG上游91bp处的腺嘌呤A。2.人类PINK1基因-1799至+26片段具有显著启动子活性,为PINK1基因功能启动子区；启动子区-78+26片段为PINK1基因启动子最短核心功能区。3.人类PINK1基因有复杂精确的调控机制,NFκB能与其启动子区有效结合。4.转录因子NFκB能够提高人类PINK1基因的启动子活性。5.转录因子NFκB上调人类PINK1基因的转录和翻译水平。