创伤会导致机体的靶细胞严重损伤，同时由于感染所致的脓毒症及非感染所致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)相互作用使得自体修复功能障碍，并进一步造成微血管损伤、微循环障碍，从而引起重要脏器功能障碍，这可能就是多器官功能障碍(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)的始发环节。而MODS是重症监护病房（intensive care unit，ICU）患者死亡的最常见原因。内皮祖细胞(endothelial progenitor cell，EPC)是血管内皮细胞的前体细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓及其它组织被动员到外周血进行损伤的修复。内皮祖细胞又称为血管母细胞(angioblast)，既参与出生后的血管生成(angiogenesis，AG)，同时亦参与机体、器官损伤后的血管再生与修复。1997年，Asahara等首次证明循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞。近年来的研究显示，内皮祖细胞是参与出生后生理性及病理性血管形成最主要的细胞，同时可以在体内分化为内皮细胞，并参与心、肝、肾等单个器官损伤或器官衰竭时的修复。因此，内皮祖细胞在创伤后缺血性疾病和创伤修复等过程中的具有重要治疗作用和广阔的临床应用前景。微囊蛋白(Caveolin)，又称小窝蛋白，为小窝最主要组成蛋白，属整合膜蛋白。微囊蛋白家族包括Caveolin-1，Caveolin-2，Caveolin-3，其主要的作用是把细胞外的生物活性分子向胞内转移，并在胞内运输并参与多种信号的接收和转运，其生理功能主要表现在维持细胞进出平衡，参与细胞增殖、迁移和信号传递。微囊蛋白-l（Caveolin-1）是其主要组成蛋白，能直接与多种信号分子如G蛋白a亚单位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成员(Src，Fyn等)、EGF受体、胰岛素受体、PKC、eNOS等连接，从而调控这些信号分子的活性状态。Tan Zh等研究发现雌激素可以通过提高Caveolin-1的表达从而促进EPC的增殖和分化，同时Caveolin-1的表达强度和EPC的功能密切相关。进一步研究发现，Caveolin-1是体内信号转导通路的枢纽，可以能直接与多种信号分子如G蛋白a亚单位、Ha-Has、Src酪氨酸激酶家族成员等连接，调控这些信号分子的活性状态。有研究显示：通过药物干预或剔除Caveolin-1可使PI3K表达下降，用β-环糊精抑制Caveolin-1可阻止PI3K活化。活化的PI3K可以激活其下游的信号转导通路磷脂酰肌醇激酶-3/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/内皮型一氧化氮合成酶（PI3K/Akt/eNOS），而该信号通路下游的内皮型一氧化氮合成酶（eNOS）的完整与否直接影响到EPC的动员、增殖和分化；而无论是PI3K/Akt/eNOS通路上游的磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）和丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（Akt）；还是下游的eNOS的效应子一氧化氮（NO）对EPC的动员、迁徙及血管形成功能都有非常重要的调节功能。Everaert研究发现，PI3K的活化能使其下游的Akt磷酸化，磷酸化的Akt可直接磷酸化eNOS，导致eNOS被激活，诱导血管内皮大量合成NO。NO可以通过作用于金属基质蛋白-9（mmp-9）促进EPC的动员、迁徙和血管形成功能，并可灭活细胞凋亡的关键酶caspase-3和caspase-6等，从多条途径抑制EPC和血管内皮细胞凋亡。本研究通过从不同组织（外周血、骨髓、脐血和脐带）中成功分离培养出内皮祖细胞，并在体外模拟缺血、缺因子环境下培养EPC，使EPC受损，观察EPC表面Caveolin-1的表达与EPC功能的关系，并在EPC体外培养体系中，利用RNA干扰技术调控Caveolin-1的表达强度，以及尝试阻断Caveolin-1信号转导通路PI3K/Akt/eNOS，观察EPC功能的变化。以明确Caveolin-1与EPC功能的相关性及其调控作用机制，从信号转导通路的角度进一步研究MODS的发生和发展机制，并通过改善创伤后内皮祖细胞功能，为有效防治MODS提供确实的理论依据和实验基础，并为临床创伤后MODS的有效防治提供新的方法。第一部分不同组织来源的人内皮祖细胞的分离、培养和鉴定目的：从不同组织中分离培养内皮祖细胞，并对比不同组织来源的内皮祖细胞功能的优劣，从而挑选出组织来源方便及功能优良的内皮祖细胞，为最终能够获得用于细胞移植或组织工程的种子细胞提供基础。方法：采用密度梯度差速贴壁培养法及组织块植块法，分别从外周血、骨髓、脐带血及脐带组织中分离培养内皮祖细胞，结合细胞形态学特征、细胞的超微结构、细胞免疫表型、乙酰化的低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL)和荆豆凝集素-1（FITC-UEA-1）的吞噬功能、体外血管生成功能进行鉴定，并对比不同组织来源的内皮祖细胞功能的优劣。结果：除外周血来源的细胞不能增殖传代，从骨髓、脐带血及脐带组织中均能成功分离培养并扩增内皮祖细胞，骨髓来源的内皮祖细胞连续传4代以上，细胞形态发生改变，而脐带血及脐带组织来源的内皮祖细胞可稳定传10代以上，细胞形态无明显改变。细胞呈集落样生长，继而增殖加速，周边出现梭状分化细胞，培养至约20天以后，出现了内皮细胞样的“铺路石”状，同时电镜观察细胞发现有内皮细胞特有的特征性的Weibel-Palade小体存在，符合内皮祖细胞的形态特点；流式细胞仪检测细胞表型发现，三种组织来源的内皮祖细胞都表达CD133、CD34、CD31和KDR，CD133和CD34的表达随培养时间增加逐渐下降，而CD31和KDR的表达随时间增加而升高；双吞噬功能鉴定发现超过85%体外培养的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1；体外血管形成实验显示：三种组织来源的内皮祖细胞均具有血管形成能力。对比三者的功能后发现，脐带及脐带血来源的内皮祖细胞较骨髓来源的内皮祖细胞，无论是稳定维持祖细胞的特性，还是增殖能力及成血管能力都较强。且按照每根脐带中位长30cm计算，原代平均可获得大量的内皮祖细胞（约1.51×l07个）。结论：从骨髓、脐带血及脐带组织中能成功分离培养出内皮祖细胞，并能传代扩增。脐带来源的内皮祖细胞形态学特征及功能与脐血来源的相似，无论是稳定维持祖细胞的特性，还是增殖能力及成血管能力相对于骨髓来源的内皮祖细胞来说都较强。且按照每根脐带中位长30cm计算，原代平均可获得大量的内皮祖细胞（约1.51×l07个），且培养方法简便、可靠。为最终能够获得用于细胞移植或者组织工程的种子细胞的临床应用做准备。第二部分微囊蛋白-l的表达与内皮祖细胞功能的相关性研究目的：证明内皮祖细胞功能受损时与其表面的微囊蛋白-l（Caveolin-1）的表达变化密切相关。方法：采用无血清无因子培养法，在体外使脐带来源的内皮祖细胞受损，检测其增殖和血管形成能力等功能变化及其表面微囊蛋白-l的表达。再通过RNA干扰技术抑制内皮祖细胞表面微囊蛋白-l的表达后，检测其增殖能力和血管形成能力等功能变化。结果：无血清无因子培养法可以诱导内皮祖细胞损伤凋亡，且随时间延长，凋亡增加，并且其血管形成能力也显著降低，其表面Caveolin-1的表达较正常组显著下降(P＜0.01)，并且随着内皮祖细胞损伤的加重，Caveolin-1的表达逐渐降低。说明内皮祖细胞的功能变化与其表面Caveolin-1的表达相关。利用RNA干扰技术成功抑制脐带来源的内皮祖细胞Caveolin-1的表达后，Caveolin-1RNA干扰组细胞增殖能力明显下降(P＜0.05)，且细胞的血管形成能力也明显下降。结果表明，抑制Caveolin-1mRNA的表达，可以抑制内皮祖细胞的生长和血管形成等功能。结论：当内皮祖细胞受损时，其生长及血管形成能力降低等功能变化与其表面Caveolin-1的表达密切相关。抑制内皮祖细胞Caveolin-1mRNA的表达后，内皮祖细胞的增殖能力和血管形成能力显著下降。从而说明了内皮祖细胞表面Caveolin-1的表达可以调控其功能。通过正向调控Caveolin-1可以改善创伤后内皮祖细胞的功能，从而为有效防治多器官障碍提供确实的理论依据和实验基础。第三部分微囊蛋白-l对内皮祖细胞功能调控的机制探讨目的：探讨Caveolin-1是否通过PI3K/Akt/eNOS信号转导通路调节内皮祖细胞功能的变化。方法：在内皮祖细胞体外培养体系中，分别利用Caveolin-1、PI3K和Akt特异性抑制剂β-环糊精、LY294002和triciribine阻断信号转导通路后，观察该信号转导通路的下游产物磷酸化Akt蛋白和NO(间接反映eNOS)的表达情况及内皮祖细胞的生长和血管形成等功能变化，以证实Caveolin-1是否通过PI3K/Akt/eNOS信号转导通路调节内皮祖细胞功能的变化。结果：β-环糊精、LY294002抑制Caveolin-1和PI3K后，其下游的磷酸化Akt蛋白和NO(间接反映eNOS)表达均减少，加之triciribine抑制Akt后，eNOS表达减少，说明β-环糊精阻断Caveolin-1后，通过阻止PI3K活化来抑制Akt磷酸化，进而影响eNOS的活化造成NO产生减少。三组抑制组细胞与对照组相比，其细胞增殖能力和成血管能力都明显下降（P＜0.05），说明了Caveolin-1通过PI3K/Akt/eNOS通路可调节内皮祖细胞的功能。当然，Caveolin-1可能还通过其它通路来调节内皮祖细胞的功能，这就需要我们更进一步的研究。结论：当内皮祖细胞受损时，其表面Caveolin-1表达降低，细胞增殖能力和成血管能力随之下降。内皮祖细胞表面的Caveolin-1表达减少，影响了PI3K的活化，使Akt磷酸化减少造成eNOS的活化减少，进而NO产生减少，导致内皮祖细胞的增殖能力和成血管能力等功能下降，进而影响机体修复。总之，当某些疾病（如缺血、创伤、甚至MODS）造成内皮祖细胞受损时，内皮祖细胞表面的Caveolin-1表达减少，影响了PI3K的活化，使Akt磷酸化减少造成eNOS的活化减少，进而NO产生减少，导致内皮祖细胞的增殖能力和成血管能力等功能下降，进而影响机体修复。这一结论为我们从信号转导通路的角度进一步研究MODS的发生和发展机制，并通过改善创伤后内皮祖细胞功能，为有效防治MODS提供确实的理论依据和实验基础，并为临床创伤后MODS的有效防治提供新的方法。