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研究背景:肾母细胞瘤(Wilms’tumor,WT)是儿童泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,发病高峰年龄为1-3岁,约有5%的患儿双侧肾脏受累,年发病率为1/10000。大多数患儿为散发病例,大约有10%WT病例伴发生殖细胞突变和(或)先天性发育畸形,比如Beckwith-Wiedemann、Denys-Drash、Perlman和WAGR等综合征。WT是起源于原始后肾胚基的恶性混合性肿瘤,主要包含上皮、间质和胚芽等成分,除了以上三种典型成分外,WT中也可能包含软骨、骨样组织及神经组织等成分,这些异质性成分提示WT病因的复杂性并激发科研人员数十年的积极探索。WT1作为WT第一个抑癌基因,于1990首次被克隆。随后,CTNNB1、WTX等基因突变相继被发现并克隆。WT1、CTNNB1和WTX基因突变约占到总病例数的1/3。同时,WT的发生发展还与其他许多基因改变有关,比如p53、MYCN、CITED1、SIX2、TOP2A及CRABP2等。尤其是在间变型WT中发现有75%存在p53基因突变,提示该基因突变是组织不良型WT的不良预后标志物,可能与WT进展、复发及转移有密切关系。近年来,相继有多个研究团队报道发现WT中与小RNA相关基因突变(如DROSHA和DGCR8),约15%WT的样本中被检测出。与MYCN基因突变一样,DROSHA和DGCR8等基因突变也只是小众突变基因,还有大量wt的驱动基因的突变尚未明确。目前已有大量拷贝数改变及杂合性丢失(loh)等相关病例报道,其中一些改变如11ploh和17p拷贝数减少已明确影响相关基因,但其他位点如1q拷贝数增加、1p拷贝数减少及16q拷贝数减少等尚不能确认与具体基因相关。maw等于1992年首次报道了16qloh变异频率,并证实部分伴发1ploh。随后nwts-3和nwts-4的两项研究结果表明,1p和(或)16qloh与不良预后存在正相关性,并建议该类患儿需要强化化疗。因此,探讨wt的病因,寻找wt的分子生物学标志物,对儿童wt的诊断、治疗及预后具有重大的价值。过去数十年,已有大量wt相关基因突变频率被报道,但结果常常差异较大,究其原因可能与研究样本量、种族差异及测序方法各异等因素有关。为了克服单个研究的局限性,本课题首先采用系统评价方式,全面阐述与wt相关基因的功能和生物学意义。随后采用新一代测序技术,对wt与癌旁正常组织全转录组高通量测序,筛选相关差异表达基因并进行功能验证。本文的主要研究内容及结果如下:第一部分:wt相关基因变异频率的系统评价目的:基于系统评价,全面分析wt相关基因变异频率及意义。方法:计算机检索pubmeb、ovid、embase和cochranelibrary等数据库,检索时限截至2015年9月。由2名研究员按照纳入与排除标准独立筛查文献、提取信息和评价质量后,应用stata12.0软件进行系统评价。结果:1.wt1、wtx和ctnnb1基因总变异约占总病例数的1/3。2.p53的突变与组织不良型wt有关。3.mycn在wt的发生率并不高,它可能不是wt的驱动基因缺陷。4.drosha、dgcr8等基因改变可能与wt病因有关,但仍需更多大样本实验证实。5.loh在wt病因诊断中敏感性较低,需要结合其他生物学标记分析。第二部分:wt全转录组测序分析目的:构建wtcdna文库,筛选差异表达基因。方法:1.采用高通量深度测序分析法,对wt组织及癌旁正常组织进行全转录组测序。2.q-pcr验证差异表达基因。结果:1.成功构建cdna文库。2.筛选出差异表达候选基因有asic1、scg5、hnrnpl和cacnb4等。3.q-pcr验证asic1、scg5、hnrnpl及cacnb4等差异表达基因与测序结果基本一致。第三部分:hnrnpl在wt增殖、凋亡中的调控作用及机制研究目的:探讨hnrnpl在wt增殖、凋亡中的调控作用及机制研究。方法:1.利用rna免疫共沉淀方法探讨hnrnpl蛋白与p53mrna之间的关系。2.构建sirnahnrnpl表达载体,体外转染g401细胞株,mtt法分析g401细胞生长变化,流式细胞术检测细胞调亡情况。体内裸鼠实验,观察肿瘤生长情况。3.q-pcr和westernblot检测hnrnpl基因被抑制后g401细胞hnrnpl、p53和bcl2mrna和蛋白质的表达。结果:1.rna免疫共沉淀实验证实hnrnpl能与p53的mrna特异性的结合。2.沉默hnrnpl基因后,g401细胞体内外生长抑制、细胞凋亡加速。3.沉默hnrnpl基因后,hnrnpl、p53和bcl2mrna和蛋白质的表达下调。结论:与wt相关的基因改变包括:wt1、wtx、ctnnb1、p53、mycn、drosha、dgcr8等基因,以及多个位点的拷贝数改变及杂合性丢失等。但以上改变频率并不高,目前还有大量驱动基因尚未确认,需要以后进行基因测序研究探明。通过转录组测序成功构建cDNA文库,筛选出差异表达候选基因有ASIC1、SCG5、hnRNPL和CACNB4等。发现hnRNPL在WT中表达上调,并能与p53的mRNA特异性的结合。沉默hnRNPL基因后,hnRNPL、p53和Bcl2的mRNA及蛋白表达下调,G401细胞体内外生长抑制、细胞凋亡加速。hnRNPL可能通过p53/Bcl2信号通路参与WT的增殖与凋亡。