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背景：肝细胞癌是一种预后较差的致命癌症，其发病率和死亡率年年攀升。肝癌治疗有效方法的研究一直没有取得显著进展。基因治疗作为肝癌治疗研究领域的重点，受到国内外的关注。Survivin基因特异性过表达于大多数肿瘤，与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，被认为是理想的抗癌治疗靶点。靶向抑制survivin基因表达可以减弱肿瘤细胞的抗凋亡能力，发挥抗癌功效。RNAi技术是进行基因治疗的新工具之一，可以高效阻断体内特定基因表达，诱导细胞增殖过程中的基因沉默效应，具有低毒性。siRNA和shRNA是RNAi技术中常用的效应片段。siRNA的沉默效应是瞬时的，而shRNA与基因载体结合后，可以实现稳定转染，导致靶基因mRNA分解，达到持续抑制靶基因的理想治疗效果。但是，如何将外源基因高效的导入靶细胞内是亟待改善的关键技术之一。超声介导微泡破裂技术（ultrasound-targeted microbubble destruction, UTMD）近年来发展迅速，是进行基因治疗的一种新方法。它通过产生声孔效应，一过性升高细胞或微血管的通透性，从而提高细胞摄取基因的能力。但是，该方法存在载体功能的不足，即微泡携带基因量未能达到理想值，如将其用于治疗，需要增大造影剂用量。因此如何提高超声微泡的载基因量是目前亟待解决的问题。目的：1.初步优化肝癌细胞HepG2转染相关声学参数；2.利用正负电荷吸引的原理，构建超声微泡联合脂质体载体系统，运载shRNA质粒对survivin基因进行靶向抑制；3.比较该载体系统与基因转染传统方法的转染效率、细胞活力和蛋白水平抑制率。材料和方法：1.主要实验材料实验仪器：Acusonic1MHz超声治疗仪、FACS Calibur流式检测仪、Nanodrop1000分光光度仪、倒置荧光显微镜、PARADICM多功能读板仪、IS4000MM凝胶成像分析系统、Xcell SureLock Mini-Gel电泳槽、Xcell II blot module、恒压电泳仪EPS301。实验材料：脂氟显超声微泡造影剂、HepG2细胞、去内毒素质粒大量抽提试剂盒、DMEM高糖型培养基、胎牛血清FBS、脂质体Lipofectamine2000、pcDNA6.2-EmGFP质粒、shRNA重组质粒、MOPS SDS buffer kit、台盼蓝染色试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、CCK-8试剂盒、ab11304鼠抗人tubulin单克隆抗体、ab93274鼠抗人survivin单克隆抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG。2.实验方法⑴将HepG2细胞交叉间隔接种于24孔板，待其生长至一定密度时，添加脂氟显微泡和GFP质粒到各组细胞中。根据3个优化声学参数分为三个组：超声强度梯度组（A组），分为A1~A5亚组，分别是0.4W/cm2、0.8W/cm2、1.2W/cm2、1.6W/cm2和2.0W/cm2；占空比梯度组（B组），分为B1~B3亚组，分别是10％、20％和50％；时间组（C组），分为C1~C3亚组，分别是30s，90s，180s。在辐照24h后，分析各组运载基因的效率及各自对细胞活力的影响：用荧光显微镜定性观察绿色荧光蛋白表达情况，流式细胞术定量检测转染率，和台盼蓝染色检测细胞死亡率。⑵构建1对GFP标记的survivin基因shRNA质粒，分别为P(+)和P(-)。将HepG2细胞交叉间隔接种于24孔板中进行实验。加入P(+)的各组分别为：空白对照组（A组）、单纯超声组（B组）、脂质体2000组（C组）和超声+微泡组（D组）、超声+微泡+脂质体2000组（E组）；加入P(-)的为阴性对照组（F组），其转染条件与E组相同。观察各组的基因转染率和细胞存活率：利用荧光显微镜及流式细胞术比较基因运送效率，CCK-8检测细胞活力，并运用western blot检测各组survivin蛋白的抑制水平。结果：1．超声强度的增加可以提高基因转染率，但是在超过一定强度后，由于细胞活力受到影响，死亡率随之增加，转染效率会出现相应下降。本研究发现，采用1.2W/cm2的超声强度转染HepG2时，转染率和死亡率优于其余声强组；2．随着占空比的增加，转染效率的变化趋势也是先上升后下降。采用20%的占空比转染HepG2时，转染率和死亡率优于其余占空比组；3．辐照时间也是影响细胞转染的一个重要因素。在一定范围内增加时间，可以提高转染效率，但当超过90s后继续增加时间，对于转染率和细胞死亡率的影响无明显统计学意义(P>0.05)；4．与单纯脂质体组相比，联合运用超声微泡与脂质体，可以在不增加细胞死亡数量的前提下，得到更高的转染效率，差异具有统计学意义（P<0.05）；与超声微泡组相比，联合运用超声微泡与脂质体的转染效率也高出很多，差异具有统计学意义（P<0.05）；5．脂氟显微泡对转染效率的提升起到了重要作用，不添加微泡时转染效果会有大幅度下降。超声微泡组转染效率明显高于单纯超声组，差异具有统计学意义（P<0.05）；6．Western blot结果显示，与空白对照和阴性对照相比，各组survivin蛋白表达水平均出现不同程度的下调（P<0.05）；其中超声微泡联合脂质体组survivin蛋白表达下调比率为（92.82±2.69）%，明显高于其余各组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明目的shRNA片段具有抑制survivin基因表达的效果，也从蛋白水平进一步说明，运用超声微泡联合脂质体的方法进行转染，可以得到更好的基因沉默效果。结论：1．超声辐照微泡是一种介导基因体外转染的有效方法，优化参数将有利于促进基因转染，得到较高的转染率，较低细胞死亡率。超声强度1.2W/cm2，占空比20%，辐照时间90s，分别为各亚组的相对最优条件，具有统计学意义（P>0.05）；2．利用正负电荷吸引法构建超声微泡联合脂质体载体系统，运载shRNA质粒对肝癌细胞survivin基因进行靶向抑制，可取得理想抗癌效果，其转染效率、靶基因蛋白水平抑制率明显高于其余各组，为进一步的在体实验奠定必要基础。