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三孢布拉霉是一类已用于工业化生产类胡萝卜素的丝状真菌,具有很重要的经济价值。利用传统诱变策略选育三孢布拉霉优良菌株效率低下,基于代谢工程改造技术则有望提升菌株改造效果。然而,三孢布拉霉的DNA双链断裂修复以非同源末端连接修复（Non-homologous End Joining,NHEJ）为主,同源重组（Homologous Recombination,HR）频率极低,造成遗传改造困难。因此,阻止三孢布拉霉胞内非同源末端连接修复对于开发针对该菌株的高效遗传改造工具具有重要的意义。本论文克隆并分析了三孢布拉霉中涉及非同源末端连接修复途径的基因Btku70和Btku80,并尝试对这两个基因进行敲除,获得三孢布拉霉敲除菌株ΔBtku70和ΔBtku80,在此过程中,探究了三种转化方法介导敲除的效率、缺陷突变株ΔBtku70和ΔBtku80与野生型菌株的表型差异,以及为三孢布拉霉开发了反向筛选标记。本论文的主要研究结果如下:（1）三孢布拉霉Btku70和Btku80基因克隆与生物信息学分析。基于三孢布拉霉基因组序列信息,通过blastp比对,克隆了三孢布拉霉Btku70基因和Btku80基因,结果表明Btku70基因全长2686 bp,c DNA序列长1839 bp,编码613个氨基酸,有2个结构域,分别为v WFA、KU78;Btku80基因全长2716 bp,c DNA序列长2202 bp,编码734个氨基酸,有3个结构域,分别为v WFA、KU80、Ku-PK-bind。氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,三孢布拉霉ku基因与瓜笄霉更相似,同源性更高。（2）比较了三种转化方法在介导三孢布拉霉Btku70、Btku80基因敲除的效果,构建了根癌农杆菌介导三孢布拉霉原生质体的遗传转化系统。研究发现Ca Cl2/PEG介导的原生质体转化法因再生率低,在筛选培养基上没有出现转化子,根癌农杆菌介导孢子转化法得到11个转化子,但均为假阳性,而农杆菌介导原生质体转化的方法有20-30个转化子生长,经PCR检测和测序验证,18-21个转化子存在敲除片段,转化率为70%-90%,获得了1株ΔBtku70、2株ΔBtku80,敲除率为3%-10%。（3）ΔBtku70和ΔBtku80的表型分析。与三孢布拉霉野生型菌株相比,ΔBtku70和ΔBtku80两缺陷株在生长速率较慢,产孢量较少,对DNA分子损伤剂（H2O2、MMS）、温度、渗透压敏感度基本一致。但在遗传稳定性检测时,发现ΔBtku70菌株、ΔBtku80菌株在传到第5代时出现敲除基因恢复情况。（4）为三孢布拉霉开发新的反向筛选标记。在致死基因HSVtk的研究中发现,野生型菌株的生长不受底物F2d U的抑制,而携带有致死基因HSVtk的转化子随着培养基中F2d U浓度提高,生长逐渐受到抑制,浓度为50μmol·L-1时转化子无法生长,表明致死基因HSVtk可应用于三孢布拉霉的反向筛选。