论文部分内容阅读
研究背景及目的:肿瘤的细胞治疗属于肿瘤生物治疗范畴,旨在通过应用免疫学原理和方法,调节机体的免疫状态从而达到治疗肿瘤的目的。按照不同机制可分为主动性和过继性免疫治疗两大类,被认为是继手术、放化疗之后的又一肿瘤综合治疗方法。原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤,主要包括原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)、肝内胆管细胞癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝细胞癌-肝内胆管细胞癌混合型等不同病理类型,其中HCC约占原发性肝癌的90%。HCC是我国发生率最高的恶性肿瘤之一,恶性程度较高,发病一般非常隐匿,确诊时大多数患者已达BCLC中晚期,从而失去了根治性治疗的机会,预后较差。因此HCC的免疫治疗已成为医学界的研究热点。本研究采用多靶点抗原肽自体免疫细胞治疗技术(multiple antigen stimulating cellular therapy,MASCT)诱导成熟树突状细胞(dendritic cell,DC)和细胞毒性 T 细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL),将成熟DC和CTL回输到患者体内,旨在探索MASCT治疗HCC诱导患者体内免疫应答研究及联合TACE的临床疗效。研究方法:1.MASCT诱导原发性肝细胞癌患者体内免疫应答研究分离HCC患者PBMC,贴壁细胞培养分化为非成熟DC,并负载14种抗原肽,加入促成熟因子培养分化为抗原提呈的成熟DC,成熟DC与非贴壁细胞共培养,分化形成抗原特异性CTL。用免疫荧光的方法分析抗原肽是否能被DC内化以及进入胞内的分布情况,并对回输的DC及CTL进行细胞表型及细胞因子检测。用HLA-A2+患者 CTL 和 HCC 细胞系 HepG2 细胞(HLA-A2+)、HuH-7 细胞(HLA-A2-)分别作为效靶细胞进行体外细胞杀伤实验,分析CTL杀伤肿瘤细胞的HLA限制性。前瞻性纳入13例HCC根治术后患者,每个患者预计接受3个疗程MASCT治疗,治疗期间按时随访,患者被诊断肿瘤进展,立即终止研究,转为传统治疗。患者随访期间,采集患者PBMC,分析治疗前后体内免疫应答情况,分别进行(1).T细胞亚群检测;(2).抗原特异性T细胞增殖(Edu染色)及IFN-y水平测定;(3).各抗原单肽特异性免疫应答检测。2.MASCT联合TACE治疗原发性肝细胞癌的临床疗效研究回顾性分析2010-15年南方医院肝病中心收治的66例接受TACE治疗的HCC患者,按是否联合MASCT治疗分为联合治疗组(32例)和单纯TACE组(34例),单纯TACE组采用TACE治疗,联合治疗组在TACE间歇期进行MASCT治疗。主要观察指标为两组患者的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)。探索联合MASCT治疗能否提高TACE的疗效,延长PFS和OS。研究结果:1.MASCT成功诱导培养mDC和CTL,多次治疗后可改善HCC患者体内免疫抑制状况,诱导特异性免疫应答经过上述MASCT细胞培养过程,患者每次接受皮下注射的DC平均2.23 ×107,这些细胞高表达DC成熟信号分子,表现出完整的免疫功能性质。此外,这些DC分泌高水平促炎因子IL12,低水平免疫抑制因子IL10。免疫荧光试验显示,抗原长肽能有效地被imDC内化,主要定位于细胞质而非溶酶体。患者每次接受回输的CTL平均6.63 × 109,这些细胞几乎全是CD3+T细胞,大部分为CD8+T细胞,小部分为CD4+和CD3+CD56+(NKT)细胞,极少量的调节性T细胞(Treg)。此外CTL上清中检测到一定量的IFN-y和TNF-α,极少量免疫抑制因子IL10和IL4。产生于HLA-A2+患者的CTL对HepG2细胞(HLA-A2+)表现出更强的细胞杀伤活性相对于HuH-7细胞(HLA-A2-)。MASCT治疗后患者不良反应少,多次MASCT治疗后,患者外周血NKT细胞,CD56+NKG2D+细胞,和效应T细胞比例上调,Treg细胞比例持续下调。此外,T细胞特异性增殖及分泌IFN-γ的能力均显著提高,T细胞对HCC抗原肽库及多种抗原单肽产生了特异性免疫应答,且未复发患者PBMC的特异性免疫应答水平显著高于复发患者。2.MASCT治疗可以显著提高TACE的疗效,延长PFS和OS。联合治疗组和单纯TACE组中位PFS分别为9.5个月和5.5个月,差异有统计学意义(p=0.001);联合治疗组和单纯TACE组中位OS分别为19.5个月和10.5个月,两组对比有统计学差异(p=0.033)。是否接受MASCT治疗、治疗前AFP水平、门静脉侵犯、ECOG评分是影响HCC患者PFS的独立预后因素;而是否接受MASCT治疗、治疗前总胆红素水平、门静脉侵犯是影响OS的独立预后因素。研究结论:1.本研究表明MASCT技术可成功诱导培养mDC及CTL,并可改善HCC患者体内免疫抑制状态,诱导针对肿瘤抗原肽的特异性免疫应答,且.会随着治疗次数的增加而增强应答。2.MASCT治疗可以显著提高TACE的疗效,延长PFS和OS。