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目的:用悬浮克隆培养技术,在体外从新生大鼠的海马分离神经干细胞,并进行扩增传代培养,观察其增殖、迁移及多潜能分化特性,为下一步试验打下基础。 方法:解剖显微镜下取新生大鼠海马组织,0.125%的胰蛋白酶溶液消化后,分别以4×10~4/ml、4×10~5/ml和4×10~6/ml三种密度接种于25cm~2培养瓶中悬浮培养,2-3天半量换液,6-7天后传代。将培养的神经干细胞球接种在放入24孔内板涂有多聚赖氨酸的玻璃盖片上,在不同培养基条件下观察其贴壁后的迁移、增殖和分化。应用抗Nestin、抗MAP2、抗MBP和抗GFAP进行细胞化学染色鉴定。 结果:自新生大鼠海马组织培养获得的细胞培养后形成的细胞球为Nestin阳性,能够耐受多次体外传代。10~4/ml这一接种密度由于细胞量少,发生细胞重聚的可能性降低,有利于干细胞的克隆形成。这些细胞接种后贴壁培养可以分化为MAP2阳性的神经元、MBP阳性少突胶质细胞及GFAP阳性星形胶质细胞。神经干细胞球贴壁后在含有bFGF及IGF-1培养基内分化,细胞迁移的距离明显较不完全及含小牛血清的培养基条件下远。 结论:1、自新生大鼠海马组织培养获得的细胞球能够自我复制,具有多种分化潜能,即可以分化为神经元、少突胶质细胞及星形细胞,并能够耐受多次体外传代,具有神经干细胞的特点。 2、bFGF及IGF-1可以促进贴壁培养的神经干细胞的迁移。 3、本实验获得的神经干细胞细胞可以体外大量增殖,能够满足我们下一步试验的需要。