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Ferlavirus(FDLV)是引起蛇类呼吸道感染的常见重要病原之一,也是广西人工养殖蛇类的常见疾病之一,临床表现典型的肺炎症状。在本研究中,首先从临床病例中鉴定FDLV,其次筛选适合培养FDLV的细胞系,然后进行培养液的改良和Vero细胞的无血清驯化,第四进行Ferlavirus的保存试验,第五设计分段引物进行Ferlavirus的基因测序,最后建立实时荧光定量PCR方法检测Ferlavirus。首先本研究首先运用RT-PCR方法检测临床送检的肺炎蛇肺脏和肝脏,将检出的Ferlavirus阳性病料于-80℃低温保存,用于病毒的分离培养。其次进行细胞系的筛选。在不同的细胞内接种同样剂量的10%的阳性病料处理液,培养24h后每隔4h观察细胞的形态,同时用红细胞凝集(HA)试验测定血凝值。再次进行培养液的改良和Vero细胞的无血清驯化。选用Earle液为基础培养基,逐步降低血清,同时添加水解乳蛋白、谷氨酰胺等添加因子,Vero细胞生长状态良好,数量倍增明显。Ferlavirus接种到无血清培养的Vero细胞中,细胞病变主要表现为产生合胞体,即多核巨细胞,胞浆呈颗粒样变化,胞膜边缘不整齐甚至模糊不清。取培养后的细胞进行HA试验和RT-PCR检测。第四,进行Ferlavirus的保存试验。Ferlavirus在环境中容易失去活性,为了获取Ferlavirus的保存方法,进行了血球凝集实验、温度敏感试验、有机溶剂敏感试验、酸性溶液敏感试验。第五,Ferlavirus的基因测序。采用分段设计引物的方式,针对Ferlavirus设计片段为1500-2000bp的测序引物,用降落PCR、梯度PCR等优化策略,优化PCR反应条件。通过建立重组质粒,将得到的基因片段插入质粒中,送检测序,使用DNAman软件将得到的基因片段拼装组合。最后建立实时荧光定量PCR方法检测Ferlavirus。针对Ferlavirus病毒的保守区L基因设计相应引物,建立Real Time PCR方法,并对Real Time PCR反应条件的优化、绘制出SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线、并对其特异性、重复性进行分析。结果表明:标准曲线的线性度较好,PCR的扩增效率也比较好,而待测样品的Ct值可以从仪器读取;将不同稀释度的标准品Ferlavirus分别进行PCR扩增,用统计学软件分析表明,所建立的Real-time PCR在组间和组内都具有良好的重复性(P>0.05),相关系数均大于0.99。从以上实验得出结论:(1)Ferlavirus能在传代细胞系BHK细胞和Vero细胞生长,不能在Marc-145细胞和PK细胞生长。(2)Ferlavirus在无血清改良培养基的Vero细胞中,传代5次,培养36小时后可观察到明显细胞病变,血凝效价大于或者等于1:27,即1:128时,红细胞凝集(HA)试验和RT-PCR检测均为阳性。(3)初始血凝效价HA为1:28的Ferlavirus病毒培养液在-80℃仅能贮存35天,加入冷冻保护剂且调节pH为中性或弱酸性后可延长贮存期到65天。(4)设计测序引物,测序并拼接后得到Ferlavirus的基因片段6458bp。(5)成功建立了 Ferlavirus的荧光定量PCR检测方法,该方法特异性强,重复性好,灵敏度高,最低可检测到10copies/μ1。