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背景:胶质瘤是中枢神经系统中常见的恶性肿瘤,约占成人颅内肿瘤的40%~50%,传统的手术、化疗及放疗等治疗效果较差。伴随着对胶质瘤发生机制的深入研究以及分子生物学技术的日新月异,分子靶向治疗逐渐成为一种有广阔前景的治疗肿瘤的新手段。Survivin是Ambrosini等利用效应细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)cDNA从人类基因库中杂交筛选克隆出来的。是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis family of protein,IAPs)的成员之一,人survivin基因全长1417kb,位于17q25,分子量16.4kD。编码产生一个由142个氨基酸组成的具有独特结构的胞浆蛋白,是迄今为止发现的分子量最小、抗凋亡作用最强的IAP。survivin在胚胎组织中普遍表达,在成人正常分化组织中(胸腺、生殖器除外)却不表达或表达很低,而在肿瘤组织中却过度表达。有研究发现survivin与肿瘤的发生、发展、复发和预后有关,抑制其表达能显著促进肿瘤细胞发生凋亡,抑制细胞增殖,而对正常组织无明显影响。因而有望成为胶质瘤基因治疗的理想靶点。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物体中普遍存在的、细胞本身固有的对抗外源基因侵害的一种自我保护现象。外源性或内源性双链DNA(dsRNA)导入细胞后,首先被RNA酶Ⅲ家族成员中一种称为dsRNA特异性核酸内切酶(dsRNA specific endonuclease,Dicer)降解成21~23核苷酸(nucleotide,nt)的小片断即小干扰RNA(Small interfering RNA,siRNA)并以其为模板,特定位点、特定间隔降解与之序列相应的mRNA,从而引发转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)。RNAi技术具有高效性、高特异性、高稳定性,此外还具有有放大效应,所谓放大效应即被降解的mRNA片段及未被降解的完整mRNA均可作为引物,在RNA依赖的RNA聚合酶作用下,合成更多的dsRNA。新合成的dsRNA进入下一轮RNAi循环。RNAi技术作为新兴的基因表达阻断技术,目前已成功用于基因功能和肿瘤相关基因等方面的研究,为临床上特异性的基因干预治疗肿瘤开辟了一条新的途径。因此,利用RNAi技术研究survivin基因诱导胶质瘤细胞凋亡及抑制细胞增殖不失为基因靶向治疗胶质瘤的好方法。目的:观察shRNA干扰survivin基因对脑胶质瘤细胞株U251凋亡及增殖的影响,并初步研究了survivin与微小染色体维持蛋2(minichromosome maintenance proteins 2,MCM2)之间的关系,为靶向survivin基因治疗胶质瘤提供理论和实验依据。从而为攻克胶质瘤这一顽症提供研究基础。方法:通过脂质体Lipofectamine2000介导对胶质瘤细胞株U251转染survivin shRNA质粒PG-sur(pGenesil-suvrivin)以及无意义序列:shRNA质粒PG。设未转染siRNA的U251细胞组为空白对照组,转染无意义序列的U251细胞组为实验对照组,转染干扰序列的U251细胞组为实验组。1采用RT-PCR和western-blot等方法分别检测三组survivin的mRNA和蛋白水平表达情况,以证实shRNA对survivin的抑制效果;2流式细胞术(FCM)定量测定各组细胞的细胞周期和细胞凋亡变化;3 MTT法检测细胞增殖能力;4原位末端标记(TUNEL)法观察各组细胞凋亡的形态学特征;5采用RT-PCR、western-blot分别检测转染survivin前后细胞MCM2mRNA和蛋白表达情况;6实验所得数据应用SASv8.0软件进行分析。结果:转染siRNA后胶质瘤细胞survivin表达明显降低(P<0.05),抑制率在90%左右。且转染48h后抑制效果最佳,各组转染U251细胞48h后,荧光倒置显微镜下各组可见大量荧光细胞;:FACS检测各组转染效果,各组转染效率均为85%上下。1流式细胞仪分析结果显示,转染siRNA后,U251细胞发生了显著的凋亡(F=20.85,P=0.002<0.01),细胞凋亡百分比37.9113±6.8134%;2原位末端标记(TUNEL)法观察转染PG-sur质粒的细胞凋亡增多;3 MTT法检测结果显示,转染后24h、48h细胞增殖能力无明显差异,72h、96h细胞增殖明显减低;4 PI染色流式细胞周期检测分析显示,转染干扰序列组细胞周期显著阻滞于G2/M期;5转染干扰序列后的U251细胞,MCM2的mRNA和蛋白表达显著降低。结论:1 survivin基因在胶质瘤细胞株U251中具有抗细胞凋亡作用;2 survivin基因在胶质瘤细胞株U251中促进肿瘤细胞的增殖;3 RNAi靶向抑制suvrivin基因可以诱导U251细胞凋亡和细胞周期阻滞,可能成为胶质瘤基因靶向治疗的新策略;4胶质瘤细胞中MCM2和Survivin的过度表达不是各自孤立事件,二者间可能起协同作用共同参与胶质瘤的发生和发展。