【摘 要】
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RNAi技术以其特异性强、环境友好等优势广泛应用于基因表达的抑制或阻断,在转基因植物产业化领域也有较好的应用前景。目前我国还未出台专门针对RNAi转基因植物的安全评价指南,为进一步细化RNAi转基因植物安全评价指标,本研究针对以Csu-miR260转基因水稻为代表性的RNAi转基因植物,开展了生物信息学、农艺性状、全转录组学的表达分析以及土壤微生物组学等方面的研究,全面比较了该RNAi转基因植物与
【基金项目】
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国家转基因科技重大专项RNAi转基因植物环境安全评价指南研究课题；
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RNAi技术以其特异性强、环境友好等优势广泛应用于基因表达的抑制或阻断,在转基因植物产业化领域也有较好的应用前景。目前我国还未出台专门针对RNAi转基因植物的安全评价指南,为进一步细化RNAi转基因植物安全评价指标,本研究针对以Csu-miR260转基因水稻为代表性的RNAi转基因植物,开展了生物信息学、农艺性状、全转录组学的表达分析以及土壤微生物组学等方面的研究,全面比较了该RNAi转基因植物与野生型之间的差异,得到了如下结果:（1）通过生物信息学分析预测出Csu-miR260转基因水稻的外源转入序列与水稻基因组不存在互补序列,也不生成非预期的miRNA,但存在潜在结合的circ RNA。该转基因抗虫水稻除与靶标害虫二化螟dib基因存在互补序列,也与家蚕以及其他螟虫同属昆虫基因存在互补序列。（2）通过农艺性状分析明确了转基因水稻Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2在主要农艺性状上与野生型ZH11存在显著性差异,主要体现在萌发期和成熟期。萌发期ZH11发芽率为95.33%,Csu-miR260-16-4的发芽率为62.67%,Csu-miR260-18-2的发芽率为40.67%,两个转基因株系的发芽率极显著低于ZH11。成熟期ZH11的株高为106.54 cm,Csu-miR260-18-2的株高矮于ZH11,为96.14 cm;成熟期ZH11的每穗实粒数为89.41粒,Csu-miR260-18-2为69.77粒,显著少于ZH11;三个品种的千粒重存在极显著差异,Csu-miR260-16-4为25.56 g,Csu-miR260-18-2为26.38 g,ZH11为23.93g。（3）通过对2个Csu-miR260转基因水稻株系和3个常规水稻ZH11、Nippon和Kita的全转录组测序分析,确定了通过农杆菌侵染和愈伤成苗的方法获得的Csu-miR260转基因水稻相比野生型ZH11在mRNA、lnc RNA、circ RNA和miRNA四种类型RNA都存在基因表达差异,但该差异远小于野生型水稻品种间的差异。相比ZH11,Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2的差异mRNA数目分别为723和1181,而Nippon和Kita的差异mRNA数目分别为1622和1295;Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2的差异lnc RNA数目分别为96和212,而Nippon和Kita的差异lnc RNA数目分别为261和206;Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2的差异circ RNA数目分别为71和67,而Nippon和Kita的差异circ RNA数目分别为89和69;Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2的差异miRNA数目分别为57和35,而Nippon和Kita的差异miRNA数目分别为123和140。可见,外源基因转入对内源基因表达的影响要小于不同品种导致的内源基因的表达差异。针对发芽率低的非预期表型开展差异RNA的KEGG/GO富集分析,发现在激素信号途径、转录因子和能量物质代谢途径都存在与种子萌发相关的显著表达差异基因。（4）通过对野生型ZH11和2个Csu-miR260转基因水稻株系根际土壤微生物组学的分析,明确了Csu-miR260转基因水稻对土壤微生物的群落结构和组成存在影响,但两个转基因株系出现的影响结果不一致。Csu-miR260-18-2中占比最高的细菌优势菌属红游动菌属（Rhodoplanes）为4.29%,ZH11为2.60%,而Csu-miR260-16-4中占比最高的细菌优势菌属GOUTA19菌属为2.79%,ZH11为4.08%。在真菌群落方面,Csu-miR260-18-2的子囊菌门（Ascomycota）和油脂酵母属（Lipomyces）的相对丰度与ZH11存在差异,而Csu-miR260-16-4的粪壳菌目（Sordariales）与ZH11存在差异。基于上述研究结果,本论文明确了转基因水稻Csu-miR260-16-4和Csu-miR260-18-2的农艺性状、全转录组层面的基因表达特征以及对土壤微生物的影响。从生物信息、农艺性状、全转录组基因表达和土壤微生物组学等方面,系统分析了Csu-miR260转基因抗虫水稻与野生型ZH11的差异,为以Csu-miR260转基因抗虫水稻为代表性的抑制外源基因的RNAi转基因植物安全评价指南的指标细化提供科学依据和技术支撑。
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