研究背景和目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率占到全身各种恶性肿瘤发病率的7%-10%,而且乳腺癌的全球发病率自20世纪末以来一直呈上升趋势,每年约有140万人被诊断为乳腺癌,约50万人死于乳腺癌。我国虽然不是乳腺癌的高发病国家,但其发病率目前也已位居我国女性恶性肿瘤的首位,是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的疾病。虽然随着人们健康意识的提高,健康查体的普遍认可,乳腺癌的早期诊断率得到提高,早诊断早治疗明显改善了乳腺癌患者的预后。而且随着乳腺癌治疗理念的进步,治疗药物的不断改进,乳腺癌综合治疗、个体化治疗的有效实施也明显提高了乳腺癌患者的生存率,延长了生存时间。但是并不是所有乳腺癌患者都有明显的获益,像预后较差的三阴性乳腺癌患者以及复发转移患者大都面临着治疗效果不理想,生存时间短的结局,这一部分患者的治疗仍然是乳腺癌基础和临床研究面临的挑战。恶性肿瘤的局部浸润和远处转移过程中都离不开肿瘤的血管生成。血管生成可以为肿瘤细胞的不断增殖提供足够的营养,为肿瘤细胞的远处转移提供桥梁。临床前期模型的研究证实,在乳腺增生恶性转化,即出现形态变化之前,血管生成就已经发生。经刺激血管生成多肽转染的乳腺癌细胞也表现出了更强的生长、侵袭和转移的能力。既然血管生成与乳腺癌的发生发展、浸润转移有密切关联,通过抗血管生成的靶向治疗可能成为乳腺癌治疗的又一种有效手段。对乳腺癌血管生成机制的深入研究,不仅有助于进一步了解乳腺癌的发展机制,也能为乳腺癌抗血管生成靶向治疗提供理论依据。研究证实,血管生成的过程需要多种分子通路的参与,亦受到多种基因及microRNA的调控。Metadherin (MTDH)基因作为一种多能癌基因,在正常组织中不表达或低表达,在恶性肿瘤中高表达。其在促进恶性肿瘤进展,浸润转移及化疗耐药等多个方面都发挥重要作用。我们的研究团队在对MTDH与乳腺癌相关的研究中证实,MTDH高表达可以通过诱导细胞发生上皮间质转化来促进乳腺癌细胞的浸润转移,能够通过调节肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体来抑制乳腺癌细胞凋亡,还能通过下调PTEN来介导ER依赖的乳腺癌的生长和他莫昔芬耐药。在研究中还发现,MTDH在乳腺癌细胞中的高表达与一些肿瘤血管新生标记物,如MMP-2、CD31等的表达上调有密切联系,MTDH可能也具有调控乳腺癌的血管生成的作用,因此此研究的目的就是探讨MTDH对乳腺癌的血管生成的调控并探索相关分子机制。MiRNA-21是最早发现的微小RNA之一,其功能类似于癌基因。研究证实在乳腺癌中miRNA-21高表达,且与乳腺癌的TNM分期、腋窝淋巴结转移具有相关性,是乳腺癌高侵袭性的独立的分子标志。miRNA-21可以通过调节金属原肌球蛋白(TPM1),程序性死亡蛋白4(PDCD4)和乳腺丝抑蛋白促进乳腺癌细胞的浸润和转移。干扰miRNA-21的表达则可以负反馈于PTEN来逆转乳腺癌细胞的EMT。我们通过微阵列基因芯片技术对干扰MTDH表达后的MAD-MB-231细胞系进行miRNA差异表达谱分析以及实时定量PCR检测,发现有91种miRNA表达水平降低,miR-21是其中下降明显的miRNA之一。有研究报道了miRNA-21可以促进前列腺癌细胞的血管生成,本研究中我们也探究在MTDH调控乳腺癌细胞血管生成的机制中,miRNA-21是否也发挥了作用。研究方法为了研究MTDH对乳腺癌血管生成的调控,我们选择具有三阴性乳腺癌特性的MDA-MB-231细胞系进行研究。前期研究已经正实,MDA-MB-231细胞系是高表达MTDH的。首先设计针对MTDH的干扰序列,构建shRNA,然后插入pSUPER.retro、pure载体,经过测序验证后用脂质体2000转染MDA-MB-231细胞系。然后筛选并建立稳定低表达MTDH的细胞系及空载体的对照细胞系。通过实时定量PCR和western blot验证干扰效果。然后收集制备肿瘤条件培养基(TCM)：消化计数等量实验组和对照组的细胞,置于相同大小培养瓶,用含10%胎牛血清的全培养基培养24小时。然后弃去培养基,PBS冲洗3遍后加入无血清培养基,细胞培养箱培育24小时候后收集上清液,先后离心去除细胞及细胞碎屑,储存于-80℃冰箱备用。通过血管生成相关的体外实验：小管形成实验、小鼠主动脉环实验和鸡胚绒毛尿囊膜实验,来检测干扰MDA-MB-231细胞的MTDH后对其血管生成能力的影响,从而揭示MTDH对乳腺癌血管生成的调控作用。小管形成实验：将96孔板用50μl基质胶覆盖,37℃放置30分钟使基质胶凝固。取对数生长期的HUVECs消化计数,用制备好的条件培养基(TCM)重悬HUVECs,然后分别取100gL约含1×105的细胞加入96孔板的每一孔中。在细胞培养箱培育6小时后,显微镜下观察管腔结构的形成情况。随机选取10个视野,计数形成的管腔结构并统计分析。小鼠主动脉环实验：将48孔板用100μL基质胶覆盖,37℃放置30分钟使基质胶凝固。在麻醉状态下,将4周龄大小的BALB/c小白鼠的胸主动脉进行分离并切下,然后将其切断,分成长度约2mm的动脉环。将动脉环放入48孔板中后,再覆盖100μL的基质胶。待基质胶凝固后,每个孔中加入200μL制备的TCM。将48孔板放到培养箱中培养,并每天显微镜下观察主动脉环的新生血管的情况,第5天记数每个孔的新生血管数量。鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验：取20枚种鸡卵随机分为2组,置于37℃相对湿度80%的恒温恒湿环境中培养3天。于之前标记好的蛋壳位置开一约1cm2的小窗,小心分离卵壳膜,避免损伤尿囊膜,使卵壳膜与尿囊膜分离形成人工气室。第二天,在无菌条件下分别将100μL不同的TCM加入尿囊膜表面,然后封闭小窗。继续孵育5-7天,收取尿囊膜,显微镜下观察血管生成情况并计数统计。除了进行细胞学的实验,我们还收集了84例人乳腺癌的组织标本,通过免疫组化技术,检测乳腺癌组织中MTDH的表达与微血管密度(MVD)之间的关系,并统计分析与乳腺癌患者临床病理特征的相关性,来进一步验证乳腺癌组织中MTDH与血管生成的关系及其临床意义。为了阐明MTDH调控乳腺癌血管生成的分子机制,我们通过实时定量PCR和western blot来检测与血管生成相关的AKT通路和ERK1/2通路的表达情况,筛选可能的信号通路。我们还检测通路下游与血管生成的分子标记物VEGF、MMP2,了解它们表达水平的变化。为了探究是否有microRNA (miRNA)在MTDH调控血管生成的机制中发挥作用,我们通过微阵列基因芯片技术对干扰了MTDH的MDA-MB-231细胞进行miRNA的差异表达谱分析及实时定量PCR的验证,发现miRNA-21是差异表达明显的miRNA之一,于是我们用脂质体2000向干扰了MTDH的MDA-MB-231细胞中瞬时转染了miRNA-21 mimics。收集制备条件培养基,然后通过小管形成实验,小鼠动脉环实验来验证转染miRNA-21 mimics后对MDA-MB-231-prpM细胞的血管生成能力的影响。因为PTEN是miRNA-21的下游靶基因之一,且参与调控ERK1/2通路,因此我们检测了转染miRNA-21 mimics后,MDA-MB-231-prpM细胞的PTEN表达情况,并检测转染miRNA-21 mimics后VEGF、MMP2的表达水平变化。结果构建的干扰载体并经测序检测后,转染至MDA-MB-231细胞系。通过嘌呤霉素筛选建立稳定的低表达MTDH的MDA-MB-231-prpM细胞系,以及空载体的对照MDA-MB-231-prpn细胞系。通过实时定量PCR、western blot检测干扰效率,可见MTDH在mRNA水平和蛋白水平均明显降低(P<0.01)。为了解干扰MTDH基因表达对乳腺癌血管生成的影响,我们首先通过小管形成实验,将TCM作用于HUVECs,观察MTDH对小管形成能力的影响,结果显示干扰MTDH的MDA-MB-231-prpM细胞能明显抑制其小管形成能力(P<0.01)。将TCM作用于小鼠主动脉环,观察动脉环周围新生血管的形成,我们发现干扰MTDH的MDA-MB-231-prpM细胞的新生血管形成能力明显降低(P<0.05)。通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验,我们发现MDA-MB-231-prpM细胞的TCM明显抑制绒毛尿囊膜的血管生成(P<0.05)。通过对人三阴性乳腺癌组织标本的免疫组化染色,检测MTDH和微血管密度标记物CD31的关系：84例组织标本中,MTDH高表达48例,其中CD31高表达33例；MTDH低表达36例,其中CD31高表达14例,差异具有统计意义(P=0.017),相关性分析也发现MTDH表达与微血管密度相关(r=0.698 P=0.006),而且MTDH高表达还与乳腺癌的肿瘤大小、腋窝淋巴结转移、TNM分期,脉管浸润具有相关性。通过对血管生成相关分子通路的筛选,发现干扰MTDH表达后,p-AKT表达升高,p-ERK1/2表达降低,血管生成相关的分子标记物VEGF、MMP2均明显降低。故认为MTDH调控血管生成的通路为ERKl/2通路,而不是AKT通路。我们在MDA-MB-231-prpM细胞系内瞬时转染了miRNA-21 mimics后,通过实时定量PCR来检测证实miRNA-21表达水平明显上调(p<0.01),然后通过小管形成实验和小鼠动脉环实验来验证miRNA-21上调对MDA-MB-231-prpM细胞血管生成能力的影响,发现MDA-MB-231-prpM细胞的小管形成能力明显提高(p<0.01)。通过小鼠主动脉环实验将TCM作用于小鼠主动脉环,观察新生血管分支情况,发现上调了miRNA-21的MDA-MB-231-prpM细胞形成新生血管分支的能力也较前提高(P<0.05)。但与MDA-MB-231-prpn比较仍有差异(P<0.05),这一结果证实了上调miRNA-21水平后可以部分逆转干扰MTDH对MDA-MB-231细胞血管生成的抑制作用。通过western blot实时定量PCR检测发现miRNA-21下游的PTEN表达下降,p-ERK1/2上升,VEGF和MMP2的表达水平升高。结论1.干扰MTDH可以抑制乳腺癌的血管生成2. MTDH通过MTDH/miRNA-21/PTEN/ERK1/2通路来调控乳腺癌的血管生成意义1.证实了MTDH调控乳腺癌的血管生成的功能。2.初步阐述了MTDH调控乳腺癌血管生成的分子机制。3.为MTDH成为乳腺癌分子靶向治疗的新靶点提供了理论依据。