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1研究目的中医理论博大精深,中药复方是中药临床应用的主要形式,复方中药味之间的伍用关系是中医理论的精髓所在。探寻复方的配伍机理是中药复方研究工作的重中之重。本研究以戊己丸作为工具药,采用正交试验设计的方法,借助肠肝灌流模型,从吸收、代谢、胆汁排泄的角度考察戊己丸不同配伍中代表成分小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、芍药苷在肠肝灌流液和胆汁中的动态变化,借以分析戊己丸组成药物对方剂的贡献度和贡献形式,探讨其配伍机理；考察戊己丸不同配伍肠肝灌流液对离体肠管、结肠平滑肌细胞的影响。综合药动学、药效学实验结果,探索建立PK-PD模型,为中药方剂配伍机理研究提供借鉴。2研究方法和结果2.1肠肝灌流模型的优化Ⅰ方法：通过考察不同配方的灌流液(共8组)对各组的pH、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)活性,肝、肠干湿重比的影响,分析灌流液组成成分对肝功能、肝细胞损伤以及组织水肿程度的影响。结果：第8组灌流液(不加红细胞、地塞米松、去甲肾上腺素)的pH,LDH, ALT与第1组灌流液(加红细胞、地塞米松、去甲肾上腺素)相比无显著性差异：第8组灌流液肠干湿重比与正常对照组相比无显著性差异。结论：红细胞、地塞米松、去甲肾上腺素对于维持肠肝灌流模型功能无显著影响。2.2肠肝灌流模型的优化Ⅱ方法：通过考察不同配方的灌流液(共4组)对各组的灌流液回收率、乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)活性,以及肝、肠干湿重比的影响,比较不同灌流液的缓冲能力以及其对模型功能状态的影响。结果：与第1组(K-H缓冲液,1%BSA)相比,第2组(K-R缓冲液,1%BSA)的灌流液回收率显著升高(P<0.01);LDH.ALT(?)舌性显著降低(P<0.05,P<0.01)；与正常对照组相比,各组肝脏干湿重比显著降低(P<0.01),肠道干湿重比无显著性差异。结论：将K-H缓冲液换成K-R缓冲液理由充分,可以运用到下一步实验当中。2.3戊己丸大鼠原位循环肠肝灌流液PK的研究方法：采用L9(34)正交设计表,将戊己丸组方中的黄连、吴茱萸、白芍作为3因素,各因素的3个不同剂量作为3水平,借助循环肠肝灌流模型,考察戊己丸不同配伍方及其相应剂量的单味药对代表成分吸收分数,吸收速率常数的影响。应用单因素方差分析(ANOVA)、正交设计的极差分析、方差分析对实验结果进行统计分析。结果：对于提高戊己丸中小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、芍药苷吸收分数的最优配伍比例分别是黄连：制吴茱萸：炒白芍＝3:1:3、3:1:3、3:1:6、3:1:3、3:1:6。对于加速戊己丸中小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱、芍药苷吸收的最优配伍比例是黄连：制吴茱萸：炒白芍=3:1:3、3:1:3、3:1：12、3：1：6、3：1：6。2.4戊己丸大鼠原位循环肠肝灌流液PD的研究方法：制备豚鼠离体肠管,考察不同配伍、不同时间点的戊己丸循环肠肝灌流液对乙酰胆碱所致的离体肠管收缩的影响。采用DAS3.0软件对药理效应进行评价。结果：乙酰胆碱显著收缩肠管,表现为张力显著增加(P<0.01)。与空白对照组相比,1、2、4-8组均有显著的抗乙酰胆碱作用(P<0.05, P<0.01)。DAS3.0软件分析结果显示贡献度大小排序为黄连>白芍>吴茱萸,其中黄连有统计学差异(P<0.05),确定了黄连在戊己丸中君药的地位。2.5戊己丸大鼠原位单次肠肝灌流液PK的研究方法：采用L9(34)正交设计表,将戊己丸组方中的黄连、吴茱萸、白芍作为3因素,各因素的3个不同剂量作为3水平,借助循环肠肝灌流模型,考察戊己丸不同配伍方及其相应剂量的单味药对代表成分的吸收分数,门静脉吸收药-时曲线下面积(AUC),肝脏摄取率、肝脏摄取率。通过单因素方差分析(ANOVA)、正交设计的极差分析、方差分析对实验结果进行统计分析。结果：在单次灌流模型中,有助于提高小檗碱吸收量、肝脏摄取率的最优配伍比例分别为为黄连：制吴茱萸：炒白芍=12:1：12,3:6:3；有助于提高巴马汀吸收量、肝脏摄取率的最优配伍比例分别为为黄连：制吴茱萸：炒白芍=6:1：12,3:2:3；有助于提高吴茱萸碱吸收量、肝脏摄取率的最优配伍比例分别为黄连：制吴茱萸：炒白芍=12:6:6,12:1：12;有助于提高吴茱萸次碱吸收量、肝脏摄取率的最优配伍比例分别为黄连：制吴茱萸：炒白芍=12:6:6,6:6:12；有助于提高芍药苷吸收量、肝脏摄取率的最优配伍比例分别为为黄连：制吴茱萸：炒白芍=6:2:12,3：2：6。2.6戊己丸大鼠原位单次肠肝灌流液PD的研究方法：制备急性分离的离体结肠平滑肌细胞,考察不同配伍、不同时间点的戊己丸单次肠肝灌流液对乙酰胆碱所致的离体结肠平滑肌细胞收缩的影响。采用DAS 3.0软件对药理效应进行评价。结果：乙酰胆碱显著收缩细胞长度,细胞收缩率达到22.87%,有显著性差异(P<0.01)。与模型对照组相比,经90min灌流液预处理后,黄连高剂量组,1号方、3号方、4号方、7号方组的细胞长度明显增加(P<0.05),黄连低剂量组、黄连中剂量组,5号方组的细胞长度明显增加(P<0.01);120min灌流液预处理后,黄连低剂量、5号方、7号方的细胞长度明显增加(P<0.05)。DAS3.0软件分析结果显示贡献度大小排序为黄连>白芍>吴茱萸,其中黄连有统计学差异(P<0.05),说明黄连在戊己丸中是治疗肠痉挛类疾病的主要药物(应为君药)。2.7戊己丸单次肠肝灌流液PK-PD联合模型方法：应用Winonlin 6.1软件对戊己丸单次灌流液的浓度和药效进行拟合结果：戊己丸的PK-PD模型是一种抑制模型,即浓度越高,收缩率越低,这与实验结果一致。得到PK-PD方程E=Emax×(1-(Ce/(Ce+EC50))).其中1、2、3、6、9号方的拟合曲线与实测曲线吻合度较好。2.8戊己丸大鼠胆汁排泄的研究方法：考察不同配伍对戊己丸代表成分胆汁排泄率和胆汁排泄药-时曲线下面积(AUC)的影响。通过单因素方差分析(ANOVA)、正交设计的极差分析、方差分析对实验结果进行统计分析。结果：促进小檗碱、巴马汀、吴茱萸碱、吴茱萸次碱胆汁排泄的最优配伍分别是黄连：吴茱萸：白芍=12：1:6,12：1:6,3:6：3,6：6：3。配伍方的胆汁排泄均显著低于同剂量单味药(P<0.01)。3结论’本实验利用肠肝灌流模型,研究戊己丸不同配伍和单味药对代表成份吸收、代谢、排泄的影响。主要表现为吴茱萸限制黄连代表成分的吸收,促进其肝脏摄取,抑制其胆汁排泄；白芍促进黄连代表成分的吸收,抑制其肝脏摄取,促进其胆汁排泄；黄连、白芍均促进吴茱萸代表成分的肝脏摄取,抑制其胆汁排泄：黄连抑制白芍代表成分的肝脏摄取,促进其胆汁排泄。并得出促进吸收、代谢、排泄的最优配方。药理实验结果显示戊己丸对于乙酰胆碱所致的离体肠管收缩,结肠平滑肌细胞收缩有拮抗作用。统计分析结果显示黄连在方中的贡献度最大(为君药),制吴茱萸和炒白芍次之(为臣药)。