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鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)在感染鸭后可导致鸭生产性能下降,病程后期可引起典型的神经症状,严重情况下可导致发病动物死亡,这给我国养鸭业带来严重的危害,此外,国内外已多次报导坦布苏病毒感染人的事件,这同样给我国公共卫生安全带来一定的挑战。坦布苏病毒粒子包含囊膜,其基因组长度大约为11 kb,只含有一个开放阅读框,该阅读框可编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白;此外,在开放阅读框的5’和3’端各包含一个非编码区,其中5’端非编码区由94个核苷酸组成,而3’端非编码区由618个核苷酸组成,两个非编码区虽然不被编码成病毒蛋白,但却有着丰富的生物学功能,两者在病毒基因组的复制及翻译等过程中发挥调控作用。研究表明,某些黄病毒在复制过程中,随着病毒基因组的不断复制,基因组的3’非编码区会产生一些长度约为0.3-0.5 kb的亚基因组RNA(subgenomic RNA,sgRNA),这类RNA具有丰富多样的生物学功能。sgRNA的积累是黄病毒属病毒特有的一个现象,该类产物的形成往往是由病毒基因组3’UTR(Untranslated region,UTR)自身保守的高级结构阻挡了宿主5’-3’核酸外切酶XRN1对基因组的降解而导致,其中,sgRNA 5’端结构在这一过程中发挥了不可替代的作用,这些高级结构的存在保护了下游序列不被降解,而下游序列形成的高级结构可与RNA或者蛋白相互作用来执行相关生物学功能。近年来对于黄病毒sgRNA的研究持续不断,而目前有关DTMUV sgRNA的鉴定和功能探索国内外均未见报道,所以本课题以此为契机开展了DTMUV sgRNA的相关研究,研究过程中采用高通量测序、分子杂交以及核糖核酸酶XRN1的处理技术对DTMUV的sgRNA进行了鉴定。首先通过对Northern blot结果进行分析,可直观上明确DTMUV sgRNA的产生,高通量测序结果则表明在DTMUV感染细胞后会有大约500nt的小片段RNA富集,该类小片段RNA来自于DTMUV基因组3’UTR,结合3’UTR二级结构预测结果,可确定DTMUV sgRNA序列全长大约为528 nt。接着将此序列与DTMUV全基因组序列进行比对,明确了sgRNA在病毒基因组中的准确定位;此外,通过对sgRNA进行二级结构预测,我们获得了完整的DTMUV sgRNA二级结构信息,并且经过分析后发现了位于3’UTR中可阻碍XRN1消化作用的结构,以此为基础进一步分析后,我们明确了该结构中易突变位点,通过对构建的DTMUV感染性克隆的sgRNA锚定区域进行突变,拯救出sgRNA产生能力下降或消失的DTMUV突变株;通过突变株体外实验可知sgRNA在DTMUV致细胞病变及病毒基因组复制过程中发挥重要作用;此外通过突变株雏鸭感染实验证明了sgRNA可影响DTMUV对雏鸭的致病能力。通过本研究,我们明确了DTMUV sgRNA的产生,也验证了DTMUV sgRNA的相关功能,同时也为研发DTMUV sgRNA缺失侯选疫苗株提供了理论依据。