目的:类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要特征的全身性自身免疫性的多因素相关的复杂疾病。现有的治疗方法仍不能治愈或永久摆脱RA的症状。部分患者经系统正规治疗仍有迁延不愈,随病情进展出现不可逆的关节畸形和功能丧失。自身免疫性风湿性疾病的病因尚未完全了解,涉及遗传和环境因素。维生素D可抑制体液免疫反应并增强免疫耐受性,预防或减轻自身免疫性疾病。越来越多的研究发现维生素D（vitamin D,VD）缺乏与RA相关。关于VD补充剂在RA治疗中的潜在作用的研究结果不一致。为确定提升不足的血清25羟维生素D（25 hydroxyvitamin D,25（OH）VD）水平是否对预防和治疗RA患者有益处,本实验设计了临床试验、动物实验和体外实验探讨VD对RA的相关作用及机制研究。本研究通过以下三方面进行:1.25羟维生素D水平与类风湿关节炎相关指标及合并疾病的相关性:研究25羟维生素D水平在RA患者和健康人中的差异及其与RA活动性的相关性。通过病例对照研究分析25（OH）VD水平是否是RA合并类风湿血管炎（Rheumatoid vasculitis,RV）或冠心病的危险因素之一。2.维生素D对大鼠胶原诱导的关节炎模型的影响:通过大鼠胶原诱导的关节炎（Collagen Induced Arthritis,CIA）模型验证CIA造模是否可模拟RA患者血清25（OH）VD水平下降,适量维生素D3干预纠正CIA大鼠降低的25（OH）VD水平,是否影响大鼠血钙、血脂、关节症状、滑膜组织病理学表现,以及炎症因子水平和脾脏淋巴细胞亚群。3.维生素D在大鼠胶原诱导的关节炎模型中的作用机制研究:研究CIA造模大鼠低25（OH）VD水平是否与高表达的维生素D受体（Vitamin D receptor,VDR）相关。以及VD干预对细胞核因子κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路的影响。研究CIA造模及VD干预对CIA大鼠血管功能相关指标的影响。研究25（OH）VD水平对人滑膜组织分泌细胞因子的影响。研究方法:1.按自然月招募首诊RA患者和健康对照者,记录RA组患者病程,晨僵时间,压痛关节数,肿胀关节数,C反应蛋白（C-reactive protein,CRP）,血沉（Erythrocyte sedimentation rate,ESR）,类风湿因子（Rheumatoid factor,RF）,抗环瓜氨酸肽（Anti-Cyclic citrullinated peptide,ACCP）抗体,双手X线片情况,记录患者整体健康（Global health,GH）参数,计算28处关节疾病活动性（Disease Activity Score28,DAS28）评分。检测入组时2组受试者血清25（OH）VD水平,对于25（OH）VD缺乏或不足的患者及健康对照者给予一次性口服补充维生素D3制剂30万单位,间隔4周复测2组补充后的血清25（OH）VD水平。t检验分析2组受试者25（OH）VD水平在维生素D3干预前、后及干预前后差值的差异,Spearman秩相关分析评价初始2组受试者25羟维生素D水平和干预后25羟维生素D提升水平与DAS28、CRP、RF、ACCP、GH、压痛关节数、肿胀关节数的相关性。分别招募RA合并RV和RA合并冠心病病人为实验组,按年龄病程匹配1:2配比未合并RV和冠心病的RA患者为对照组,所有入组患者均记录人口统计学,既往病史,吸烟,RA的临床特征,药物和合并症,并检测总胆固醇（Cholesterol,CHOL）、高密度脂蛋白胆固醇（High density liptein cholesterol,HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein chesterol,LDL-C）、甘油三酯（Triglyceride,TG）、血清白蛋白（albumin,Alb）、血清钙、ESR、CRP、RF、以及免疫球蛋白M、G、A,补体C3、C4,ELISA法检测ACCP抗体、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor alpha,TNF-α）、白介素6（Interleukin 6,IL-6）,免疫印迹检测ANA和ANCA,电化学发光法检测25（OH）VD,乳胶免疫比浊法检测D-二聚体。条件Logistic回归分析筛选RA患者发生RV或冠心病的危险因素。使用Cox模型探讨与RV复发相关的因素。2.选取雌性4周龄体重100克左右Wistar大鼠30只,适应性饲养后按体重分组:空白对照组6只,空白给药组6只,余18只行CIA造模,2周后选取造模成功者按体重分为造模对照组6只,造模给药组6只。空白给药组和造模对照组大鼠给予30000u/kg的维生素D3,空白对照组和造模对照组给予同等体积双蒸水。每周记录大鼠体重,关节炎评分。造模2周时鼠尾取血,造模4周时处死大鼠,留取血标本、膝关节滑膜、踝关节、脾脏标本。ELISA方法检测大鼠血清25（OH）VD水平、全自动生化分析仪检测大鼠血清钙、CHOL、HDL-C、LDL-C、TG。大鼠滑膜和踝关节苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色评估炎症及关节损伤。ELISA方法检测TNF-α、L-6水平。制备大鼠脾脏淋巴细胞悬液,流式分析CD3+CD4+/CD3+CD8+细胞比值、调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）和辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）细胞占比。3.免疫组化检测大鼠滑膜VDR的表达情况。实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,q PCR）检测滑膜VDR表达。免疫印迹法（Western blot,WB）检测大鼠滑膜中p-IκBα、IκBα蛋白水平表达。考虑血管病变可能滞后,延长CIA大鼠观察时长。我们准备了60只4周龄的雌性Wistar大鼠,体重约100克。适应性繁殖后,按体重分组:空白对照组12只,空白给药组12只,其余36只接受CIA建模。两周后,选择了12个成功的模型,并分为CIA对照组和CIA给药组。给药组大鼠被给予30,000 u/kg的维生素D3。分别在免疫4周及6周时处死大鼠并取材。检测免疫4周及6周时大鼠血清25（OH）VD、总NO、肾素、血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ,ANG-Ⅱ）,检测大鼠主动脉组织中局部肾素、ANG-Ⅱ,大鼠主动脉组织HE染色测量主动脉中层厚度,免疫组化和q PCR检测大鼠主动脉中肾素、VDR。采用RA患者滑膜组织体外培养,ELISA方法检测25羟维生素D3干预前后培养基中25（OH）VD、TNF-α,IL-6,白介素6受体α（Interleukin 6 recepter-α,IL-6 Rα）,白介素8（Interleukin 8,IL-8）,单核细胞趋化蛋白1（Monocyte Chemotactic Protein 1,MCP-1）,血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）的变化。结果:1.2014年10月1至2018年10月1,在中国医科大学附属盛京医院风湿免疫科共入组实验组268名首诊RA患者,对照组295名健康检查者,两组数据年龄及性别统计学无差异。按入组月份对比两组受试者干预前25（OH）VD水平差异,1月、2月、6月、7月、8月、9月,两组数据比较有统计学差异,25羟维生素D水平实验组低于对照组。对于血清25（OH）VD水平不足的受试者给予VD3干预后两组25（OH）VD水平在全年每个月均差异明显。比较干预前后25（OH）VD差值,两组数据比较差异更加明显。应用Spearman秩相关分析检测,初始25（OH）VD水平与DAS28、CRP、GH、压痛关节数、肿胀关节数均为弱相关,与RF及ACCP水平无相关;干预前后25（OH）VD差值与DAS28、CRP、GH、肿胀关节数压痛关节数成明显相关,与RF及ACCP水平无相关。共招募90例RV患者,配比180例RA对照。RV患者中78.9%存在维生素D缺乏。Losgist回归分析发现RV的危险因素为吸烟者（OR 2.56,CI 1.23,5.32）,类风湿结节（OR 2.48,CI 1.04,5.88）,放射线侵蚀（OR 2.33,CI 1.31,4.17）,自身免疫性甲状腺炎（OR 3.14,CI 1.22,58.13）,周围血管疾病（OR 3.14,CI 1.22,8.13）,和恶性肿瘤（OR 3.19,CI 1.05,9.8）,保护性因素为较高的HDL（OR 0.31,CI 0.13,0.7）,和较高的Alb水平（OR 0.89,CI 0.83,0.95）。随访12个月RV的复发率为17.2%。Cox模型分析RV复发的危险因素为男性（HR5.49,CI 1.55,19.61）,皮肤血管炎（HR 5.05,CI 1.28,20）,吸烟（HR 3.12,CI 1.25,7.79）和高血压（HR 4.05,CI 1.03,15.87）。共招募RA合并冠心病患者52例,1:2配比RA对照组104例。RA合并的冠心病患者多支病变占比73.1%。合并高血压（OR 3.73,CI 1.51,9.21）、较高的ESR（OR 1.03,CI 1.01,1.04）为RA合并冠心病的危险因素,应用雷公藤制剂（OR 0.36,CI 0.15,0.9）治疗和较高水平的血清25羟维生素D（OR 0.86,CI 0.79,0.94）为保护性因素。2.造模组大鼠一般状态较空白对照组欠佳,体重偏低。造模给药组大鼠体重较造模对照组在造模4周时改善。造模对照组及造模给药组大鼠关节炎评分无差异。大鼠血清25（OH）VD水平在造模后给药前较空白对照组明显降低。VD干预2周后,造模给药组25（OH）VD水平较造模对照组升高,提升至与空白对照组相当,空白给药组25（OH）VD水平明显升高。空白给药组大鼠血钙、总胆固醇水平明显升高有统计学意义,余3组无统计学差异,甘油三酯、低密度胆固醇及高密度胆固醇4组比较无差异。大鼠踝关节及滑膜HE染色结果,造模对照组可见明显异常,造模给药组轻度改善。造模组TNF-α、IL-6水平均明显增高,其中造模给药组IL-6水平较造模对照组下降,有统计学意义。造模给药组大鼠脾脏淋巴细胞亚群CD4/CD8细胞比例较造模对照组增高,两组比较Treg和Th17占总T淋巴细胞的百分比无差异。3.造模组大鼠滑膜及主动脉免疫组化VDR高表达,造模给药组表达水平略回降。q PCR检测滑膜及主动脉VDR表达造模组明显增高,造模给药组较造模对照组回降,有统计学意义。造模组p-IκBα/IκBα比值升高,造模给药组p-IκBα/IκBα比值回降。延长观察时间于造模4周及6周分别取材分析。造模组大鼠血清NO含量明显升高,相同时间点造模给药组与造模对照组无差异。大鼠血清中肾素及ANG-Ⅱ水平各组比较无差异。造模组大鼠主动脉中肾素及ANG-Ⅱ水平增高,给药4周时造模给药组肾素及ANG-Ⅱ水平较造模对照组回降。各组大鼠主动脉HE染色、主动脉中层平滑肌厚度无差异。造模组大鼠主动脉肾素水平升高,造模给药组较造模对照组有所回降。人滑膜组织体外培养,经25羟维生素D3干预后,IL-6、MCP-1水平下降,TNF-α、IL-6R、IL-8、VEGF水平与空白对照相当。结论:1.RA患者血清25羟维生素D水平不足难以纠正,维生素D干预后RA患者25羟维生素D提升水平与疾病活动性指标成负相关。2.低25羟维生素D水平可能是RA患者合并冠心病的危险因素之一。3.CIA造模可使大鼠滑膜及血管高表达VDR,血清25羟维生素D水平降低。4.维生素D干预后,CIA造模大鼠血清25羟维生素D水平回升,滑膜VDR下调,NF-κB信号通路活性下调,血清IL-6水平降低,滑膜及关节病理损伤轻度减轻,主动脉VDR下调,主动脉局部肾素、血管紧张素-Ⅱ水平下降。5.25羟维生素D干预后,RA患者滑膜组织分泌IL-6、MCP-1水平下降。