鸡球虫病是一种重要的寄生虫病，分布广，感染率高，常发生在15-50日龄的雏鸡，若不能有效控制，其现场发病率可达50％-70％，死亡率可达20％-30％，严重爆发时其死亡率可高达80％。据统计，全球养鸡业每年仅球虫病造成经济损失就达20亿英镑。目前对该病的防治仍以化学合成药及抗生素为主，但由于长期应用，易产生抗药性，且在畜产品中因药物残留而影响人类的健康。鉴此，人们将目光转向非抗生素防治研究，如中药和疫苗。沙门氏菌是一种侵袭性胞内菌，通过一定方法减毒后对宿主致病性显著降低，但仍保留良好的侵袭力，可携带重组质粒侵入脾和淋巴结等器官组织，并在宿主细胞中表达抗原而诱发特异性的免疫应答反应。以减毒沙门氏菌为载体的疫苗已用于细菌和病毒性疾病的预防研究，但国内未见以减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫基因疫苗的相关报道。本研究目的是：1)分离鉴定杭州地区鸡球虫种类；2)用中药复方进行鸡球虫病防治试验；3)克隆主要致病虫种柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)ZJ株5401基因，构建原核和真核表达质粒，利用减毒鼠伤寒沙门氏菌基因双突变株为载体传递E.tenella ZJ株DNA疫苗，研究其免疫原性及可行性。 本研究对杭州地区鸡场的球虫感染情况进行了调查，并用中药复方对实验感染球虫鸡进行防治试验。调查和防治结果表明，杭州地区主要存在3个种，即柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)，毒害艾美耳球虫(E.Decatrix)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)；中药复方煎剂对鸡柔嫩艾美耳球虫具有高效抗球虫效果，抗球虫指数(ACI)为180.8；中药复方散剂具有中等抗球虫效果，ACI为178.8。 应用RT-PCR扩增E.tenella ZJ株5401基因。按照Danforth(1989)发表的基因序列合成引物，引物上下游各加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点。PCR扩增产物约为900bp，与pGEM-T载体连接后，转化DH-5α感受态细胞，将酶切鉴定正确的阳性克隆进行测序。结果表明，E.tenella ZJ株5401基因序列全长为864bp，序列本身是一个开放阅读框，与Danforth等(1989)报道的基因序列的同源性为99.8％，有两个部位的碱基发生了有义突变；氨基酸序列同源性为99.3％。同时将5401基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a中，构建成表达载体pET-30a-5401，用IPTG诱导该基因在E.coli BL21(DE3)中表达，诱导6h的蛋白表达量即可达到较高水平，表达量约26.3％。SDS-PAGE及Western-blot证明，融合蛋白大小约为66kDa，而非推测的38.5kDa，表明该基因可能以蛋白二聚体的形式表达。 将5401基因插入真核表达载体pcDNA3，构建成真核表达质粒pcDNA3-5401，高压电转化dam和phoP基因双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌(ZJ111株)中，并直接转染Vero细胞，提取细胞总DNA，DIG标记探针可检测到阳性杂交信号。SDS-PAGE、Western-blot可检测到31kD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌能将5401基因呈递给Vero细胞并浙江大’货博一卜学位论文进行表达。 将携带鸡柔嫩艾美耳球虫5401基因的真核表达质粒pCDNA3一5401的减毒沙门氏菌ZJin菌株(ZJin/pcDNA3一5401)口服接种3日龄非免疫鸡，2周后加强免疫一次，试验过程中未见任何不良反应和鸡只死亡。二免后4周各组鸡的体重无统计学差异 (外0.05)，同时肝脏和脾脏己检测不到沙门氏菌;用限制性酶切分析和PCR鉴定证实，体内试验和体外培养的重组质粒在受体菌ZJin菌株内比较稳定。结果提示，利用减毒沙门氏菌为载体传递DNA疫苗具有良好的安全性和稳定性。 为了探讨其免疫原性和免疫保护效果，将ZJI 11/pCDNA3一5401分别以10，cfu、105cfu、l旷cfu的炙量进行首免，2周后进行二免，一免后每周采血进行淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测，持续6周，测定其免疫原性。二免后一周每组随机取12羽鸡，每羽用6X10‘个E. tenellaZJ株抱子化卵囊攻毒，攻虫后第8天，所有鸡称重、剖杀、取其盲肠，观察盲肠病变，对盲肠内容物进行卵囊计数。结果表明:重组减毒沙门氏菌zJlll/pcDNA3一5401株三个剂量组均能显著增强淋巴细胞增殖水平和抗体水平(P<O.05)，具有良好的免疫原性;其卵囊下降率分别为48.43%、55.00%和57.50%;病变记分下降率分别为20.83%、41，68%和40.83%;抗球虫指数(ACI)分别为145.86、164.98和160.2i’，后两者的ACI均高于活球虫卵囊免疫组和5401融合蛋白免疫组的ACI;地克珠利的ACI为176.44，明显高于其他各组。试验结果提示，以减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗对球虫感染鸡综合保护效果明显优于活球虫卵囊免疫组和5401融合蛋白免疫组，但低于地克珠利的抗虫效果。 综上所述，中药复方具有较好的抗球虫效果;以减毒沙门氏菌为载体传递鸡球虫DNA疫苗能诱导鸡体产生较强的细胞免疫和体液免疫应答，具有良好的综合保护效果。由于DNA口服疫苗具有使用方便、价格低廉、易于群体免疫等优点，可望代替肌肉注射或基因枪等基因疫苗的免疫方式，为研制预防鸡球虫病疫苗提供一条新的途径。但有关减毒沙门氏菌传递鸡球虫DNA疫苗的确切机理、减毒后的毒力稳定性及其生物安全性等有待进一步研究。